豬圓環病毒2型抗體膠體金檢測試紙條的研制

王貴華，王美君，湯 波，陳義峰，趙亞榮

(北京大北農動物醫學研究中心，北京 100097)

斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Post－weaning multi－systemic wasting syndrome，PMWS)主要是由豬圓環病毒2型(PCV－2)引起。豬圓環病毒有PCV－1和PCV－2兩種基因型，PCV－1不具有致病性，但在正常血清中廣泛存在。ORF1編碼Rep蛋白，是引起PCV兩個血清型之間抗原交叉反應的主要原因，因此只能用于鑒別PCV［1］。ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)，具有很強的免疫原性，在兩型之間不存在抗原交叉反應。因此Cap蛋白可作為PCV－2抗體檢測的首選抗原［2－7］。本文通過表達的Cap蛋白，結合膠體金標記技術，建立PCV－2抗體膠體金檢測試紙條，為養豬場開展PCV－2抗體監測提供簡便方法。

1 材料與方法

1．1 材料 氯金酸、檸檬酸三鈉試劑購自北京化學試劑公司;PCV－2抗原(Cap蛋白，為原核表達產物)、針對PCV－2Cap蛋白的PCV－2單抗由北京大北農動物醫學研究中心制備保存;硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜、PVC板、吸水紙均購自上海捷寧生物科技有限公司;PCV－2抗體ELISA檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司;PCV－2、PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)血清由本實驗室保存，PCV －1、CSFV(豬瘟病毒)、PRV(豬偽狂犬病毒)、PPV(豬細小病毒)等陽性血清由中國獸醫藥品監察所提供。

1．2 PCV－2抗體檢測試紙條的制備

1．2．1 膠體金的制備 用檸檬酸三鈉還原法制備濃度為萬分之四的膠體金溶液;

1．2．2 膠體金的標記 量取膠體金50mL，將膠體金調節pH值至9．0，攪拌并加入Cap蛋白1．2 mg，繼續攪拌30 min，加入20%的PEG－2000終止反應，10000 r/min離心10 min，取沉淀，再用金標緩沖液溶至50 mL，備用。

1．2．3 冷凍干燥 將標記好的膠體金溶液均勻噴涂在玻璃纖維膜上，冷凍干燥后備用。

1．2．4 抗原抗體包被 把PCV－2抗原和PCV－2單抗分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線T和對照線C，干燥備用。

1．2．5 試紙的制備 把膠體金包被好的硝酸纖維素膜、吸水紙、加樣區玻璃纖維素膜按順序貼到PVC板上，切割成條，分裝鋁箔袋，袋內裝入干燥劑，密封，常溫保存。

1．3 樣品檢測及判定標準 將試紙條放在水平操作臺上，取100μL血清滴加到樣品孔，在室溫下靜置，15 min內觀察結果。若在質控線出現紅色條帶而在檢測線處不出現紅線條帶，說明樣品為陰性;若在檢測線和指控線處均出現紅色條帶，說明樣品為陽性;若在質控線不出現紅色條帶，說明實驗不成立，需重新取試紙條進行檢測。判定標準見圖1。

圖1 試紙條判定標準

1．4 試紙條的評估

1．4．1 與 ELISA商品化試劑盒的符合率 用ELISA檢測試劑盒和試紙條同時檢測從豬場采集的38份疑似PCV－2血清，統計結果，并計算試紙條的符合率。

1．4．2 試紙條的敏感性 將標準陽性血清倍比稀釋，觀察試紙條的檢測結果。

1．4．3 試紙條的特異性 用膠體金試紙條檢測PCV －1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV 陽性血清，觀察并統計結果。

2 結果

2．1 結果判定 在質控線和檢測線處均出現紅色條帶，樣品為陽性;在質控線出現紅色條帶而在檢測線處不出現紅色條帶，樣品為陰性;在質控線不出現紅色條帶，說明試驗失敗，需重新取試紙條檢測;可疑樣品需重新檢測并與ELISA試劑盒作比較。結果見圖2。

圖2 試紙條結果判定

2．2 符合率 取38份豬血清，分別用檢測試紙條和ELISA試劑盒(武漢科前)進行PCV－2抗體水平檢測，符合率為94．7%，結果見表1。

表1 與ELISA商品化試劑盒對比結果

2．3 敏感性 將PCV－2陽性血清用PBS倍比稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16，再用 ELISA 試劑和試紙條進行PCV－2抗體水平測定，結果見表2。

表2 敏感性檢測結果

2．4 特異性 通過對 PCV －1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV陽性血清進行檢測。結果表明用試紙條檢測豬血清中的 PCV－2抗體時，與 PCV－1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV等血清無明顯的交叉反應，結果見表3。

表3 特異性檢測結果

3 討論

近年來，膠體金免疫層析技術廣泛應用于激素或多種疾病相關蛋白的檢測、病原的抗原抗體檢測、藥物濃度的檢測、食品和環境中相關物質的檢測等方面［8－12］。本研究用膠體金標記技術，將膠體金標記PCV－2Cap蛋白，結合單克隆抗體又有良好的特異性和敏感性，建立了一種快速檢測PCV－2抗體的膠體金免疫層析方法。檢測陽性樣品時，樣品中的PCV－2抗體同膠體金標記的金標抗原結合物反應，形成復合物并沿層析條向前移行，液體移行至檢測線包被區時，與預包被的PCV－2抗原形成抗原抗體復合物而凝聚顯色。游離膠體金標記的PCV－2抗原則在對照線處與PCV－2單抗結合而富集顯色;對于陰性樣本，由于沒有PCV－2抗體存在，在檢測線區將不會出現抗原抗體復合物而顯色，僅在對照線處顯色。

試紙條采用的抗原PCV－2Cap蛋白是大腸桿菌表達的可溶性蛋白經純化后的產物。通過基因工程方法可以生產大量廉價的生物活性蛋白。對照線處包被的針對PCV－2Cap蛋白的單克隆抗體，具有良好的特異性和敏感性，保證了實驗的有效性，而且單克隆抗體也可以用體外培養法大量生產，這就大大降低了試紙條的生產成本。

豬圓環病毒2型抗體免疫金標檢測試紙條，不需要實驗室和儀器設備，只要將待測血清加入加樣孔內，平放，室溫靜置15 min，即可觀察檢測結果。本試紙條與ELISA方法相比，快速、簡便、成本低、可操作性強，很適合基層養豬場進行抗體的實時監測，給養豬生產提供便利條件。

［1］ 魏 巍，楊漢春，郭 鑫，等．豬圓環病毒2型ORF2重組蛋白單克隆抗體的制備及鑒定［J］．中國獸醫雜志，2007，11(43):9－11．

［2］ Lou Z，Li X，Li Z，et al．Expression and antigenicity characterization for truncated capsid protein of porcine circovirus type 2［J］．Can JVet Res，2011，75(1):61．

［3］ Marcekova Z，Psikal I，Kosinova E，et al．Heterologous expression of full－length capsid protein of porcine circovirus2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies［J］．J Virol Methods，2009，162(1):133．

［4］ Mahe D，Blanchard P，Truong C，et al．Differential recognition of ORF2 protein f rom type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes［J］．J Gen Virol，2000，81(7):1815－1824．

［5］ Chae C．A review of porcine circovirus 2－associated syndromes and diseases［J］．Vet J，2005，169(3):326 －336．

［6］ Patterson A R，Johnson J，Ramamoorthy S，et al．Comparison of three enzyme－linked immunosorbentassays to detect Porcine circovirus－2(PCV－2)－specific antibodies after vaccination or inoculation of pigswith distinct PCV －1 or PCV －2 isolates［J］．JVet Diagn Invest．2008，20(6):744．

［7］ Lefebvre D J，Costers S，Van Doorsselaere J，et al．Antigenic differences among porcine circovirus type 2 strains，as demonstrated by the use ofmonoclonal antibodies［J］．JGen Virol，2008，89(1):177．

［8］ 陳鳳梅，李 娟，曲原君，等．免疫膠體金技術的應用及研究進展［J］．中國獸藥雜志，2004，38(8):33－35．

［9］ 張 明，吳國娟，沈 紅，等．免疫膠體金法檢測磺胺甲嗯唑殘留的研究［J］．中國獸藥雜志，2006，40(4):17－19．

［10］金顏輝，黃印堯，張長弓，等．豬圓環病毒2型抗體免疫金標檢測試紙的研制［J］．福建畜牧獸醫，2007，1(29):5－6．

［11］王慧杰，喬宏興．膠體金免疫層析法檢測豬圓環病毒2型Cap抗體方法的建立及應用［J］．中國獸醫雜志，2007，8(43):23－25．

［12］范曉娟，李 剛，史利軍，等．檢測豬圓環病毒2型抗體SPA膠體金免疫層析方法的建立［J］．中國畜牧獸醫，2009，7(36):158－160．