蜜蜂采蜜期間鏈霉素和土霉素休藥期的初步研究

柴 燕，趙新宇，周 杰

(南匯出入境檢驗檢疫局，上海 201300)

蜂蜜是我國傳統出口商品，并在世界上享有盛譽，但是我國蜂產品出口隱患并不少，蜂產品的質量安全也倍受關注，其抗生素殘留控制已成為各國食品安全工作的重要部分之一［1］。在養蜂業中抗生素是用來防治蜜蜂細菌病的常用藥物，而近些年來，藥物殘留問題嚴重影響了我國的蜂產品出口貿易［2－4］。歐盟、美國、日本等進口國對蜂蜜中的獸藥殘留提出了嚴格的限量要求，這使我國蜂蜜出口一度受阻，下降到歷史最低點［5－6］。如何做到科學養蜂、合理用藥已刻不容緩［7－9］。本實驗通過對蜂群分別施用鏈霉素和土霉素后連續跟蹤采樣進行藥殘含量檢測，進行分析得出兩種藥物殘留在蜂產品中的休藥期，以指導蜂農合理用藥［10－11］。

1 材料與方法

1．1 材料 鹽酸土霉素(98．5%)，美國Sigma公司;硫酸鏈霉素(99．0%)，美國 Sigma公司;土霉素、鏈霉素酶聯免疫試劑，德國R－Biopharm公司。

1．2 儀器與設備 臺式高速冷凍離心機，Thermo Scientific公司;多功能酶標檢測儀及其軟件SynergyTM，Bio－Tek公司;HP－5016SY氮氣吹干儀，上海濟成分析儀器有限公司。

1．3 方法

1．3．1 樣品的準備

1．3．1．1 選群 選擇群勢強且相當的4箱蜂作為試驗用蜂群，并準確定群。每種藥物用2箱蜂，做平行對照試驗。

1．3．1．2 給藥 在花期前1周，按每10足框蜂加鏈霉素、土霉素各600 mg，分3次飼喂，每次200 mg，隔2 d給藥一次。

1．3．1．3 采樣與保存 在第3次給藥后，每3天采樣一次，連續10次;然后每5天采樣一次，連續6次。每次作好標簽，置于4℃冰箱內保存待測。采集樣品時，取第1樣與第2樣應對取樣桶、器具進行清洗。

1．3．2 標準曲線的制作 根據試劑盒說明，將試劑盒中鏈霉素、土霉素各標準品溶液分別稀釋6倍，測定不同濃度標準品對抗體的抑制率，以相對吸光度B/B0(各相應濃度的藥物抑制時的OD450nm值為B值，不加藥物抑制時的OD450nm值為B0)為縱坐標，以不同標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，并推導出回歸方程，進行相關回歸分析。

1．3．3 前處理方法 含鏈霉素蜂蜜的前處理方法:準確稱取1．0 g蜂蜜樣品，加入9 mL提取緩沖液，室溫下混合10 min。將此溶液以3000 g離心10 min。用RIDA C18柱純化提取物:以2 mL甲醇(100%)和2mL蒸餾水洗滌柱子，流速為1滴/s;取樣品上清液過柱，10滴/min;再以3 mL蒸餾水洗柱，正壓去除殘留液體并且用空氣或氮氣吹2分鐘干燥柱子;用2 mL甲醇(100%)洗脫樣品，流速為10滴/min;在40～50℃用弱空氣或氮氣流完全揮發溶劑;用10 mL PBS緩沖液溶解干燥的殘留物，即10倍稀釋，待用。

含土霉素蜂蜜的前處理方法:用80 mL的帶蓋玻璃瓶準確稱取1．0 g蜂蜜樣品，用PBS緩沖液(pH 7．4，20 mM)稀釋 20倍。將此溶液超聲 5 min，然后置于渦旋混勻器上快速混合5 min，待用。檢測前將玻璃瓶上下顛倒混勻。

1．3．4 試劑盒加標回收率試驗 精確配制4．0 mg/mL的土霉素和鏈霉素溶液，取一定體積標準品溶液添加至陰性樣品，使樣品的藥物含量分別為40、20、2 ng/g，每個濃度的樣品作兩次平行提取后分別進行檢測，計算回收率。

1．3．5 試劑盒精密度試驗 在空白樣品中加入適量標準溶液，按試劑盒提供的方法樣品預處理后進行檢測。同一天內每個濃度重復5個樣，取平均值，計算日內變異系數。

1．3．6 樣品的檢測 檢測前，首先將所有的試劑必須恢復到室溫23～27℃，任何不用的試劑須立即放入2～8℃保存。將采集的樣品按照步驟1．3．3方法相應的進行前處理。全部處理完后，按照試劑盒方法說明進行檢測，分析土霉素、鏈霉素兩種藥物的休藥期。

2 結果與分析

2．1 樣品的采集 按照步驟1．3．1．2的方法對蜂群給藥，在第3次給藥后次天進行采樣，每個蜂群采集到16個樣品，4個蜂箱共采集了64個樣品。采樣期間，天氣適宜時群蜂以正常方式飼喂，遇有陰雨天時以糖水飼喂。樣品編號以藥物+箱號+采樣日期表示，如:ST/OT 01 110416(ST是Streptomycin鏈霉素縮寫，OT是Oxytetracycline土霉素縮寫)，即為2011年4月16日采集的鏈霉素/土霉素1號蜂箱樣品。

2．2 標準曲線的制作 按照1．3．2中的操作，將試劑盒藥物標準品稀釋，分別得到鏈霉素系列標準溶液(0．5、1．5、4．5、13．5、40．5 ng/mL)和土霉素系列標準溶液(1．5、4．5、13．5、40．5、121．5 ng/mL)系列，進行ELISA測定，所測的OD450nm隨著藥物標準物濃度的減小不斷增大，在檢測范圍內相對吸光值(B/B0)與藥物濃度的對數值呈線性關系，進行回歸分析，兩個藥物酶免疫試劑盒的線性關系良好。結果見圖1、圖2。

2．3 加標回收率試驗 準確稱取4份1．0 g陰性蜂蜜樣品(每種藥物各2份樣品)，分別添加40、20、2 ng鏈霉素和土霉素，樣品按照步驟1．3．3進行前處理，檢測結果見表1。經檢測，鏈霉素、土霉素平均加標回收率分別是92．7%、85．6%，與試劑盒說明書一致。

圖1 ELISA方法檢測鏈霉素的標準曲線

圖2 ELISA方法檢測土霉素的標準曲線圖

表1 鏈霉素和土霉素加標回收試驗結果

2．4 精密度試驗 量取適量的鏈霉素、土霉素標準溶液，分別添加到1．0 g陰性蜂蜜樣品中，使其終濃度分別是40、10、2 ng/mL，每個濃度重復檢測5次，計算變異系數，結果見表2。由表2可知鏈霉素、土霉素試劑盒的變異系數分別是 4．95%、6．39%，重復性好。

表2 鏈霉素和土霉素ELISA試劑盒變異系數試驗

2．5 樣品的檢測 按照1．3．5方法對采集的64個樣品進行藥物濃度的測定，結果見表3。表中的采樣時間是指給藥后的天數，如編號ST/OT 01/02 110428的樣品是指在給藥后第13天采集的樣品。

表3 樣品中藥物濃度的檢測結果

3 討論

土霉素是四環素族藥物，是一種廣譜抗生素，蜂農常用它防治蜜蜂幼蟲感染的腐臭病，因此可能會導致蜂產品中四環素族抗生素殘留。由于四環素族抗生素會在人體內富集，從而危害身體健康。鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要毒性反應為對第八對腦神經的損害，引起耳鳴，頭昏，眩暈等，若使用量較大可導致聽力減退，重聽，甚至有耳聾的可能。

日本是我國蜂蜜出口的主要國家，日本對我國蜂蜜等產品的質量要求越來越嚴格，尤其是2005年11月29日，日本厚生省在日本政府網站上發布了對日本進口所有食品制訂的新控制標準，也就是在2006年6月1日起正式實施的表格，即日本“肯定列表制度”［13］。我國有關部門也非常重視獸藥殘留，2003年我國農業部和國家質檢總局為解決蜂產品中獸藥及違禁藥物殘留問題聯合組織開展了蜂產品獸藥殘留專項整治工作。為加強獸藥殘留監控工作，保證蜂產品出口安全，于2007年7月9日第二十次修訂了出口食品安全衛生檢測監控項目，規定了蜂產品中一些藥物的最高殘留限量［14］。

根據日本肯定列表規定，出口日本蜂蜜中的四環素族抗生素殘留總量小于300μg/kg。根據國質檢食函［2006］308號文，出口日本蜂蜜中鏈霉素殘留限量不得高于 10 μg/kg［13－14］。而歐盟法規(EEC)NO．2377/90及修訂指令要求，蜂蜜中土霉素檢測限量是10μg/kg。由表2可知，鏈霉素在給藥33 d后其蜂蜜中的殘留量為5．67μg/kg，土霉素在用藥后43 d殘留量為7．77μg/kg，已經符合歐盟、日本及美國等進口方最嚴要求(低于10μg/kg)。因此，蜂農在采蜜期前45 d內切忌使用抗生素類藥物。同時，在使用相同劑量情況下，蜂蜜中的鏈霉素殘留量要明顯低于土霉素，其在蜜蜂體內的消除速度也比土霉素要快。此外，為避免產生耐藥性，建議對四環素族類和氨基糖苷類族內抗生素交替使用。

目前國內企業的出口蜂蜜質量控制項目中關鍵的問題是質劣和抗生素的超限問題，而抗生素的超限又是表現得最多的問題［15］。因此，加強源頭管理，提高蜂蜜質量，研發先進檢測技術，對我國蜂蜜產品出口而言是一件重要而且有意義的事情［16］。

［1］ 李春杰，姚 宇．中國蜂產品出口國際競爭力比較分析［J］．云南財經大學學報，2007，22(2):21－23．

［2］ 中國養蜂學會．歐盟禁我蜂蜜已波及英國、日本、美國和加拿大等國家［J］．中國養蜂，2002，53(3):31．

［3］ 劉進祖，張永貴．淺析中國蜂產品出口遭“零標準”氯霉素封殺及其應對措施［J］．中國養蜂，2003，54(3):39－40．

［4］ 陳振起．日本對進口蜂蜜新的列表制度對我國養蜂業的影響［J］．蜜蜂雜志，2006，(4):23－24．

［5］ Kennedy D G，Andrew C，Robert JM．Regulatory problems caused by contamination，a frequently over looked cause of veterinary drug residues［J］．Journal Chromatography A，2000，(882):37－52．

［6］ Bell T A．Antimicrobial susceptibility data and new animal drug approval in the United States:a historical overview［J］．Agriculture，2001，196:245－251．

［7］ 趙樹榮，陳廷珠，李樹軍．控制藥物殘留，促進蜂業發展［J］．中國蜂業，2006，(5):39－41．

［8］ 陶柏成，胡智明．出口蜂戶品源頭管理模式探討［J］．中國蜂業，2006，11:11－12．

［9］ 唐林林．蜂群用藥對蜂蜜中藥物殘留影響的研究［D］．福建農林大學碩士學位論文，2008．

［10］任 琴．蜂王漿中藥物殘留來源確定及在蜂群中消除規律研究［D］．福建農林大學碩士學位論文，2008．

［11］龐國芳，張進杰，曹彥忠，等．GB/T 18932．23－2003蜂蜜中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定方法液相色譜－串聯質譜法［M］．北京，中國標準出版社，2003．

［12］李 熠，韓勝明，黃京平．氟氯苯氰菊酯條蜂場休藥期規定的驗證研究［J］．中國蜂業，2007，58(4):7－9．

［13］中國技術性貿易措施網中關于“日本肯定列表”的相關中文網站［DB/OL］．http://www．tbt－ sps．gov．cn/jpmrl/Pages/default．aspx．

［14］進出口食品安全衛生檢測監控項目一覽表(2007年7月9日第二十次修訂)［DB/OL］．http://www．ziq．gov．cn/portal/webfiles/web/file/11839652429858819．doc．

［15］馮 峰．蜂蜜中抗生素殘留超標的原因剖析及其控制對策［J］．蜜蜂雜志，2002，10:21－22．

［16］張啟明，李位三．防止蜜蜂“藥殘”超標的綜合配套措施［J］．蜜蜂雜志，2005，11:33－34．