中國北方地區漢族人群血小板膜糖蛋白ⅠbαVNTR多態性的分布與腦梗死患者CC基因型與阿司匹林敏感相關性分析

辛曉敏，蔣麗鑫，王 瑤，金英玉，張云平

（1．哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 檢驗科，哈爾濱150001；2．北京朝陽醫院京西院區 檢驗科）

糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb－Ⅸ－Ⅴ在血小板粘附于損傷的血管內皮細胞中起重要作用并參與剪切力介導的血小板活化。因此，編碼GPⅠb基因的多態性可能改變心腦血管疾病風險因素。13個氨基酸序列（絲氨酸399到蘇氨酸411）的可變串聯重復數目（variable number of tandem repeats，VNTR）導致 GPⅠbα基因呈多態性并表現為A、B、C、D四種等位基因形式。不同民族GPⅠbαVNTR多態基因分布明顯不同。

阿司匹林是最常見抗血小板聚集藥，被廣泛運用于心腦血管疾病的二級預防。然而，數據顯示阿司匹林抗血小板作用存在個體差異［1］，可能原因是一些病人存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。重要血小板膜糖蛋白等位基因的多態性可導致重要黏附受體成分表達量的變化。現已證實，阿司匹林抵抗與血小板P1A1（GPⅢa）［2，3］和 GPⅠbα VNTR多態性BC基因型［4］有關。

本研究探討中國北方地區漢族人群GPⅠbα VNTR多態性分布情況并分析VNTR多態性的存在是否對低劑量阿司匹林（100mg／d）產生抵抗作用。

1 材料與方法

1．1 對象 選取300例中國北方地區健康的漢族人群；110例腦梗死患者，入院后服用阿司匹林（100 mg／d）至少7d以上，參考 Gum 等［5］的標準排除其它疾病。本項研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會同意，所有受試對象均簽署遺傳分析知情同意書。阿司匹林抗血小板作用通過光學血小板聚集實驗檢測。參考Gum等［5］提出的阿司匹林抵抗（AR）定義：以10μmol／L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）為誘導劑時血小板平均聚集率≥70%，以0．5g／L （arachidonic acid，AA）為誘導劑時血小板平均聚集率≥20%。阿司匹林半抵抗（Aspirin semi－responders，ASR）定 義 為 只 符 合 上 述 條 件 之一［5］。

1．2 VNTR多態基因型 從人類外周血單個核細胞分離出遺傳DNA，遺傳DNA 0．4ng加入20μl PCR反應體系，該體系包括1．6μl dNTP，0．4μl上游引物（5’－CACTAC TGAACCAACCCCAAG－3’）和0．4μl下游引物（5’－TTGTGGCAGACACCAGGATGG－3’），2．0μl 10×PCR 緩 沖 液，0．1μl（5U）Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，大連，日本）。擴增條件：95℃預變性5min；38個循環，循環參數為95℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳（三硼酸鹽／EDTA緩沖液），EB染色，確定基因型。100bp DNA作為標準參照物。

2 結果

2．1 健康人群VNTR多態性分布

VNTR基因頻率見表1。PCR擴增的DNA片斷為195，234，273bp，分別對應 D、C、B等位基因，等位基因A未檢測到。等位基因C頻率最高，其次是等位基因D。

2．2 患者的流行病學特征

如表2所示，ASR患者中女性、高血壓和高血脂者占的比率較AS者高，其他危險因素在ASR和AS患者中無顯著差異。本研究沒發現阿司匹林完全抵抗的患者，ASR患者為9．1%。ASR患者用AA或ADP作為誘導劑的血小板聚集率明顯高于AS患者（P＜0．001）。

2．3 ASR和AS患者VNTR多態性的基因頻率

表3可見6種基因型：BB、BC、BD、CC、CD、DD。在AS組中，CC基因型表達最多，其次是CD、DD基因型。與AS組相比，ASR組BC和BD基因型分布增多。

表1 中國東北地區健康人群VNTR基因型與GPⅠbα等位基因

表2 患者的流行病學特征

表3 ASR和AS患者VNTR基因型頻率

3 討論

GPⅠbα是血小板膜表面主要的唾液酸蛋白，在初級止血中起重要作用。VNTR多態性研究始于日本人，他們使用十二基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。Ishida等研究證實了Moroi的發現并報道了亞洲東部地區普遍存在的最多的單體基因型；而Simsek等研究發現在美國白種人中不存在A基因型；Marchese等對意大利白種人研究發現GPⅠbα只存在 、C、D三種基因型，同時對卡斯蒂利亞和吉普賽人的研究中也檢測出這三種基因型。1999年，Aramaki等的研究表明，之前報道的僅存在于亞洲東部人群的VNTR A基因型在北美印度安人也存在。這些研究與最初的本土美洲人是從東亞移民到北美的假設相一致。

不同民族GPⅠbαVNTR多態基因型分布明顯不同。盡管一些學者報道A基因型存在于中國人群，但本研究僅檢測出中國東北地區人群B、C、D三種基因型。我們的研究與中國山東一位學者提出的相一致，可能是東北地區的人群很多是從山東省移民而來所致。

GPⅠbαVNTR多態CC基因型在既往患有腦梗死，同時對阿司匹林敏感的患者中過量表達。本研究不包括使用抗血小板藥物治療有效的心血管疾病患者。盡管VNTR多態CC基因型與阿司匹林敏感顯著相關，但由于標本量較少，仍需進一步大規模研究。

GPⅠb－Ⅸ－Ⅴ復合物是血小板表面主要的血管性血友病因子（vWF）受體。vWF與循環血液中血小板相互作用是誘發受損血管形成血栓的始動環節。GPⅠbα呈高度多態，其中一種多態性是編碼巨糖肽的VNTR，這種類似粘蛋白的片斷分隔配體結合區域從血小板膜表面，此區域包含39個堿基序列串聯重復1到4次，對應的基因型為D、C、B、A。隨著重復序列的增加，增加了巨糖肽的長度即增加了配體結合區域和血小板膜表面的距離，從而更易接近配體結合區，對剪切力也更為敏感。活性和親和力的改變決定了整合素的功能。VNTR多態C基因型比A、B基因型短，可以推斷長度的不同可以改變對VWF的親和力 ，從而影響血小板功能，盡管沒有足夠的證據加以證實［6］。

CC基因型患者對阿司匹林更為敏感，與GPⅠbα和VWF介導的剪切力引起的血小板活化相關。

體外阿司匹林抵抗有重要的臨床意義。當前研究表明阿司匹林抵抗的存在使患主要心血管事件的風險增加了3倍以上［7］。檢測阿司匹林抵抗有助于患有冠狀動脈疾病和腦血管疾病的患者預測和降低主要心血管事件的風險。當患者檢測出阿司匹林抵抗時，其他抗血小板治療尤為重要。阿司匹林抵抗是一直存在抑或隨時間發生改變仍不清楚，因此很難決定其他治療的持續性［3］。

綜上所述，通過本研究對腦血管患者提供個體化治療具有一定的臨床意義。更為重要的是抗vWF治療的療效受GPⅠbα多態性影響，因此在臨床藥物研發過程中有必要考慮到這一點。

［1］Patrono C，Coller B，Dalen JE，et al．Platelet－active drugs：the relationships among dose，effective，and side effect［J］．Chest，2001，119，39S．

［2］Macchi L，Christiaens L，Brabant S，et al．Resistance in vitro to low－dose aspirin is associated with platelet P1A1（GPIIIa）polymorphism but not with C807T（GPIa／IIa）and C－5Tkozak（GPI－ba）polymorphisms［J］．Journal of the American College of Cardiology，42（6）：1115．

［3］Pamukcu B，Oflaz H，Nisanci Y．The role of platelet glycoprotein IIIa polymorphism in the high prevalence of in vitro aspirin resistance in patients with intracoronary stent restenosis［J］．American Heart Journal，2005，149（4）：675．

［4］Gervera A，Tassies S，Obach V，et al．The BC genotype of the VNTR polymorphism of platelet glycoprotein Iba is overrepresented in patients with recurrent stroke regardless of aspirin therapy［J］．Cerebrovascular Disease，2007，24（2－3）：242．

［5］Gum PA，Kottke－Marchant K，Poggio ED，et al．Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease［J］．American Journal of Cardiology，2001，88（3）：230．

［6］Jilma－Stohlawetz P，Homoncik M，Jilma B，et al．Glycoprotein Ib polymorphisms influence platelet plug formation under high shear rates［J］．British Journal Haematology，2003，120（4）：652．

［7］Gum PA，Kottke－Marchant K，Welsh PA，et al．A prospective，blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease［J］．Journal of the American College of Cardiology，2003，41（6）：961．