兔IL-6真核表達質粒的構建及其分子佐劑效應的初步研究

張夏蘭，楊 鑫，周英順，王紅寧*

（1.四川農業大學動物科學院，四川 雅安 625014；2.四川大學生命科學學院，動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室，四川 成都 610064；3.重慶市巴南區動物疫病預防控制中心，重慶 401320）

哺乳動物白介素6是一種多功能細胞因子，又稱為B細胞分化因子、干擾素J32及肝細胞刺激因子。白介素6在哺乳動物具有廣泛的生物學活性，幾乎能影響免疫系統的所有細胞，在調節免疫應答、影響急性期的蛋白應答和造血功能等方面發揮重要作用，并與其它細胞因子相互協調，共同構成復雜的細胞因子網絡。研究表明[1－4]，哺乳動物和禽類的IL－6具有免疫佐劑效應，能增強免疫應答，同時還有資料顯示[5]，細胞因子基因真核表達質粒能夠增強疫苗的免疫效果。基于以上研究，本研究構建了中國白兔白介素6基因真核表達質粒pcDNA－IL－6，并與WHNRH株RHDV[6]核酸疫苗pcDNA－VP60、兔瘟組織滅活苗分別共同注射家兔后，觀察其對家兔免疫應答的影響。

1 材 料

實驗動物為20日齡、600～700 g的RHD非免疫中國白兔50只。質粒pMD18－T－IL－6和真核表達質粒pcDNA－VP60系本實驗室構建并保存。人“O”型紅細胞由成都市血站提供。溶菌酶、PEG8000，NH4Ac，異丙醇，NaOH，胰蛋白胨，酵母抽提物，小牛血清，葡萄糖，醋酸鈉，冰乙酸，氯仿，苯酚，無水乙醇均為分析純。

2 方 法

2.1 真核表達質粒pcDNA－IL－6的構建

將本實驗室保存的pMD18－T－IL－6與pcDNA3.1（＋）真核表達載體質粒經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，進行連接，并轉化JM109細菌。對重組質粒進行酶切及PCR鑒定后，送大連寶生物公司測序。重組質粒命名為 pcDNA－IL－6。

2.2 質粒的大量提取及純化

質粒DNA的大量提取，采取堿裂解法；純化則采取PEG（聚乙二醇）沉淀法。方法均參照分子克隆第三版進行。

2.3 質粒的脂質體包被

在免疫動物前，把脂質體和質粒按1∶1的比例混合，4℃靜置30 min即可使用。

2.4 動物分組及免疫

首免前實驗兔耳靜脈采血，分離血清，檢測實驗動物體內兔出血癥病毒特異性抗體滴度，淘汰掉大于2 log2的兔子。將50只20日齡、600～700 g的家兔隨機分為5組，免疫兩次，兩次免疫時間間隔20 d。實驗動物免疫程序見表1。

表1 實驗動物免疫程序

首免后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、70 d 對實驗兔耳緣靜脈采血，自動凝集析出并收集血清，56 ℃30 min滅活，－20℃保存待檢。

2.5 特異性抗體的檢測及數據分析

兔瘟特異性抗體檢測采用血凝抑制（HI）試驗進行，檢測結果抗體效價用2n表示。應用SPSS11.0對同一時間段不同組別、同一組別不同時間段得血清特異性抗體水平進行統計和分析。

2.6 攻毒保護試驗

用實驗室保存地兔出血癥病毒分離株WHNRH，于免疫后70 d接種試驗兔，每只皮下注射0.5 ml（100LD50）進行攻毒，然后統計實驗兔地發病及死亡情況，對死亡兔只做病理剖解。

3 結 果

3.1 真核表達質粒pcDNA－IL－6構建結果

通過質粒PCR、雙酶切和測序鑒定（見圖1），IL－6基因按照正確的閱讀框架插入到pCDNA3.1（＋）質粒中，pcDNA－IL－6真核表達質粒構建成功。

圖1 兔IL－6 RT－PCR及質粒p MD－IL－6鑒定結果

3.2 特異性抗體檢測結果

特異性抗體檢測結果，以血凝抑制抗體的最高倍比稀釋倍數2的次方值表示，（若血清抗體的最高血凝抑制效價是 “5”，則血清的稀釋滴度為1：25）。pcDNA－VP60真核表達質粒，與真核表達質粒pcDNAIL－6免疫兔，以及pcDNA－IL－6與不同的疫苗免疫家兔之后，均產生了不同程度的RHDV特異性抗體，各實驗組與空載體對照組相比，差異均極顯著（P＜0.01）。其中，核酸疫苗與pcDNAIL－6分子佐劑組合產生的抗體水平最高，單獨使用核酸疫苗效果最差，各組之間抗體水平在不同的時間段的差異不一致，從從差異不顯著到差異極顯著。特異性抗體在首免后抗體逐步上升，二免前兔瘟組織滅活苗上升相對核酸疫苗迅速，而核酸疫苗上升緩慢。二免后RHD核酸疫苗誘導的免疫應答開始明顯上升。免疫后28 d抗各種疫苗誘導體達到峰值水平，免疫后70 d有的免疫組抗體明顯下降(表2)，免疫后血清抗體動態變化曲線見圖2。

圖2 兔免疫后血清抗體動態變化曲線

3.3 攻毒保護試驗結果

攻毒后第1 d，對照組就有實驗兔死亡，第2 d未注射pcDNAIL-6真核質粒組的實驗兔開始死亡，第4d之后就沒有實驗兔死亡。攻毒后死亡情況：對照組注射質粒載體pcDNA3.1(+),實驗兔全部死亡，注射核酸疫苗pcDNA-VP60組，死亡3只，其他實驗組無兔只死亡。對死亡兔進行剖解，其病理變化表現為：氣管和支氣管黏膜充血；肝腫大，呈黃褐色，質脆；脾臟腫大，呈黑紫色；腎呈暗紅色，被膜下和切面有大量出血點；肺表面有大小不等的出血斑，嚴重者甚至整頁肺出血；膀胱內有黃褐色較濃稠的尿液；淋巴結腫大。

4 討 論

將細胞因子重組蛋白用于佐劑存在的主要缺陷是半衰期短，其活性易受內環境如PH值、各種水解酶及血漿蛋白的影響；同時，大劑量的細胞因子還可導致發熱、炎癥等副作用。受DNA疫苗以質粒作為抗原載體的啟發，以重組質粒表達的細胞因子，即細胞因子基因佐劑，可以克服這些缺點而得以在DNA疫苗這個領域中得到更多的重視和研究。且基因佐劑1次少量接種即可在機體內長時間低量表達，而且表達產物接近天然狗構象，是體內存在的免疫效應因子，對機體無毒副作用。

許多細胞因子，已被證實能增強DNA免疫應答的強度，發揮佐劑的作用。郭焱等[1]報道，共表達IL-6基因質粒能夠促進小鼠免疫應答；龍章富等[3]報道，豬IL-6基因能夠增強小鼠對豬帶絳蟲抗原基因的免疫應答；嚴琳等[4]研究報導，豬IL-6基因的原核表達產物對偽狂犬病基因缺失疫苗具有免疫佐劑效應。目前，有關中國白兔IL-6的免疫學特性研究，國內還未見報道。了解中國白兔IL-6在家兔免疫應答中的作用，具有重要意義，研究新型的分子免疫佐劑，提高疫苗免疫應答能力，有重要實用價值。

本研究首次構建了中國白兔IL-6真核表達質粒pcDNAIL-6，并將其與兔瘟組織滅活苗和pcDNA-VP60 DNA疫苗聯合免疫試驗兔，實驗結果表明，分子佐劑pcDNAIL－6與疫苗聯合免疫時可促進機體產生快速持久的免疫應答，證明了分子佐劑pcDNAIL－6對pcDNA－VP60 DNA疫苗和RHD組織滅活苗具有免疫佐劑效應，能增強機體抵抗病毒的能力，這與其他關于哺乳動物IL－6基因真核表達質粒佐劑效應研究結果基本吻合。同時，從實驗結果還可以看出，從免疫后第14 d開始，共注射了pcDNAIL－6/脂質體復合物的試驗組抗體水平顯著高于未注射pcDNAIL－6/脂質體復合物試驗組，說明真核表達質粒pcDNAIL－6在接種后14 d才表現出免疫增強作用，說明真核表達質粒進入機體后，需經10～15 d方可得到良好的表達，與DNA疫苗進入機體后誘導機體產生免疫應答的時間基本一致。

關于中國白兔IL－6分子佐劑效應研究，國內尚未見報道。本研究對中國白兔IL－6真核表達質粒分子佐劑效應的研究，為進一步研究中國白兔IL－6的免疫學特性提供了基礎材料。

[1] 郭焱，金寧一，張應玖，等.共表達HIV－1與IL－6核酸疫苗質粒誘導小鼠免疫原性的研究[J].中華徽生物學和免疫學雜志,2002,22(2)：174.

[2] 郭斐，陸柔劍，孫朝暉，等.非復制重組痘苗病毒中白細胞介素6的表達及其對重組病毒免疫效果的形響[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2002,16(2)：136－141.

[3] 龍章富,高榮,孟民杰,等.脂質體包裹豬白細胞介素6基因對豬帶絳蟲抗原基因免疫小鼠的影響[J].高技術通訊，2003,(3)：25－29.

[4] 嚴琳，何啟蓋，陳煥春,等.豬IL－2與IL－6的原核表達及其對偽狂犬病基因缺失疫苗的佐劑效應研究[J].中國農業科學,2003,36（10)：1213－1218.

[5] 原冬偉，劉家森，郭東春，等.兔出血癥病毒VP60基因真核表達質粒的構建及初步評價[J].2011,31(11)：1582－1586.

[6] 李建文，王紅寧，田浪，等.兔出血癥病毒（RHDV）WHNRH株的分離鑒定及基因組全序列的測定與分析[J].微生物學報，2006,46(5)：720－725.