沙門氏菌的熱裂解氣相色譜-質譜分析

2012-10-08 02:22:00董海燕施點望

質量技術監督研究 2012年1期

關鍵詞：分析

董海燕，施點望，衛敏

(福建省纖維檢驗局，福建福州，350026)

沙門氏菌是屬腸桿菌科的重要病原菌屬，有史以來，沙門氏菌都是食品行業的重要檢測指標。而對于紡織行業，沙門氏菌是羽絨及其羽絨制品的必檢指標[1]，檢測周期很長，一般為5～7d[2-3]，過程相當繁瑣，尤其是過濾過程，相當耗時，難以適應市場檢驗中快速、簡便、精準的要求。因此尋求一種較為實際的快速檢測方法具有重要現實意義和理論價值，值得研究。

Py-GC-MS技術具有簡便、快速、靈敏和可重復性強等優點，它已日益廣泛地應用于檢出和鑒別微生物[4-5]。本研究利用Py-GC-MS技術對沙門氏菌全細胞進行了條件分析，確定了適合進行沙門氏菌的Py-GC-MS的條件以及部分裂解產物的結構，從而為快速鑒定沙門氏菌提供一種新方法，縮短羽絨中沙門氏菌的檢測周期，為羽絨檢測標準的實施和修正提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi A），菌株編號：CMCC（B）50093，購自廣東環凱微生物科技有限公司，產品批號：10072104B。

1.2 試驗試劑

營養肉湯培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司；37%甲醛溶液（福爾馬林）為分析純；無菌水，本試驗室自制。

1.3 儀器設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；PY-2020is熱裂解儀，安捷倫；G1888-7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀，安捷倫；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；KA-1000臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜，蘇州凈化設備有限公司；ZHWY-100B型恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；VDRTEX-5混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 菌體制備

1.4.1 接種菌液和培養

用1mL營養肉湯，將凍干粉菌種制成菌液。然后取0.1mL菌液接種至10mL營養肉湯培養基中，置37℃培養箱中，100轉/min，振蕩培養24h。再取1mL菌液接入100mL營養肉湯中，繼續置37℃培養箱中，100轉/min，振蕩培養24h。

1.4.2 滅活和收集

將1mL的37%甲醛溶液加入到100mL的培養液中將其滅活。滅活后的培養液，經4000轉/min離心數次后，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌2次后，再加入0.1mL的無菌水，旋渦振蕩后分裝至樣瓶。

1.4.3 預冷和凍干

將分裝好的菌體，置于-20℃冰箱，冷凍24h后，置于冷凍干燥機中，冷凍干燥成粉狀后保存備用。

1.5 熱裂解氣相色譜-質譜條件

1.5.1 裂解條件

裂解溫度650℃，時間為12s，表面溫度280℃，進樣量：0.2mg。

1.5.2 氣相色譜條件

色譜柱（DB-17MS，30m×0.25mm）；升溫程序：起始溫度44℃（2min），采用5℃/min的速率上升至200℃（8min），然后300℃后運行2min；分流比為1：50；載氣為氦氣。

1.5.3 質譜條件

離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，電離方式EI，電離電壓為69eV，質譜數據庫為安捷倫公司數據庫。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌熱裂解氣相色譜圖

沙門氏菌全細胞經650℃熱裂解，裂解產物為多種低分子質量物質，在優化后的氣相色譜-質譜條件下，可得到清晰的總離子流色譜圖，并對主要熱裂解產物對應的色譜峰進行了數字標識，色譜峰號分別是：1#-10#，如圖1所示。

2.2 沙門氏菌熱裂解產物分析

沙門氏菌全細胞在650℃裂解時，裂解產物經氣相色譜分離后，再由質譜系統進行分析，譜圖經儀器自帶譜庫檢索，由人工解析，對主要的10種裂解產物進行了結構鑒定，結果見表1。結果表明：熱裂解產物分為四大類，其中，第一類：脂肪族裂解產物，主要以二氧化碳為代表，該類物質是沙門氏菌全細胞高度裂解的產物，其產率最高；第二類：芳香族裂解產物，以甲苯、苯酚、對甲苯酚、苯乙腈等為代表，該類物質的主要特征是含有苯環；第三類：烯類裂解產物，其代表物質是1-十三烯；第四類：雜環類裂解產物，其代表物質是：腺嘌呤、2-呋喃甲醇。

2.3 沙門氏菌熱裂解產物化學結構分析

沙門氏菌全細胞經熱裂解后，10種主要產物的化學結構式及其對應的CAS#如表2所示。經理論分析，沙門氏菌屬腸科細菌，是一類單細胞物質，其構架組成主要為肽聚糖（由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替相連而形成的多糖鏈）、脂類、蛋白質（由氨基酸組成）、DNA（脫氧核糖核酸，組成單位是核苷酸，而糖類與磷酸分子由酯鍵相連，組成其長鏈骨架）和RNA（核糖核酸，由核苷酸單元長鏈組成，每個單元含有一個含氮堿基、一個核糖苷和一個磷酸基）[6-7]。經分析沙門氏菌全細胞組成物質的化學結構和表2中沙門氏菌熱裂解產物的化學結構，結果表明：裂解產物一部分是由于高溫而產生的炭化產物（比如：二氧化碳），一部分是由于高溫造成分子之間連接鍵的斷裂而形成的單一結構（比如：嘌呤、吲哚等物質）。

2.4 沙門氏菌部分熱裂解產物質譜分析

沙門氏菌全細胞經650℃熱裂解，形成的裂解產物經色譜分離后，用質譜系統進行分析。根據裂解產物的離子碎片信息，經安捷倫化學物質譜庫檢索進行定性鑒定，確認了大部分裂解產物的化學結構，其匹配度較高；但由于匹配度較低而存在小部分裂解產物的結構無法確定。其中圖1中2#峰上的2個質譜圖如圖2和圖3所示；圖1中10#峰上的2個質譜圖如圖4和圖5所示。結果表明：2#對應的2個質譜圖的m/z極其一致；且10#峰對應的質譜圖m/z也極其一致，這說明圖1總離子流色譜圖中的峰純度很高。