5－氮雜胞苷對大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導分化的研究

孫思 杜小文 徐劍煒a

（1.復旦大學附屬中山醫院急診科，a整形外科，上海 200032；2.浙江省金華市人民醫院泌尿外科，浙江 金華 321001）

骨髓基質中的多能細胞能夠分化成為多種中胚層來源的間質細胞，故被稱為骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。這些細胞在一定條件下可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌樣細胞，而且經過20～30個培養周期，仍能保持多向分化的潛能[1－2]。

本試驗采用密度梯度離心和貼壁分離相結合的方法分離培養大鼠BMSCs，用形態學觀察和流式細胞儀鑒定其表面抗原特性；用5－氮雜胞苷（5-azacy tidine，Sigma）在體外作用于大鼠BMSCs，誘導其向肌樣細胞分化，最后通過免疫組化染色來鑒定這些細胞的蛋白表達；旨在探討體外誘導BMSCs向橫紋肌肌細胞分化的可行性，為干細胞在組織工程學的應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 標本采集 選用1周齡SD大鼠，處死后置于75%乙醇中浸泡10 min。無菌條件下分離大鼠的四肢長骨，用1 mL注射器抽吸培養液（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium，DEME，Sigma），從骨髓腔內沖出骨髓，將骨髓液注入Percoll細胞分離液試管中，890 g／min離心，取中間的單個核細胞懸浮層，再加入培養液2 mL制成單細胞懸液，再離心后棄去上清液，加入2 mL培養液吹打制成細胞懸液。臺盼藍細胞計數后將單細胞懸液以1×105／mL的密度接種于直徑10 cm的無菌培養皿內（培養基含10%優質胎牛血清），置于5%CO2、37℃條件下培養。

1.2 細胞培養 接種后第2天更換培養基，去掉非貼壁細胞，以后每3 d換液1次。待5～10 d細胞生長融合達90%時，用0.25%的胰蛋白酶加2 g／L乙二胺四乙酸（EDTA）3 mL，消化細胞。然后將細胞以1∶3接種于直徑10 cm培養皿培養，加入10 mL培養液，于37℃恒溫、5%CO2環境中培養。

1.3 表型鑒定 取傳至P3代后的細胞，通過流式細胞儀檢測熒光異硫氰酸鹽（fluoresceine isothiocyanate，FITC）熒光標記的 CD29、CD34、CD45、CD105細胞表面抗原。

1.4 誘導分化 將已長滿的P2代BMSCs用EDTA消化后，按1∶3重新接種于含10%優質胎牛血清培養基的24孔板內，接種3 d后換液，在新培養液中加入5－氮雜胞苷10μmol／L，作用24 h。24 h后棄去含5-氮雜胞苷的培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，改用含5%優質胎牛血清的培養基繼續培養，每3 d換液1次。

1.5 免疫組化 1周及3周時分別取接種于24孔板內的誘導細胞進行免疫組織化學蘇木精－伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、結蛋白、α－橫紋肌動蛋白（α-sacromeric actin，α-SMA）染色，與未經誘導的BMSCs比較，并在顯微鏡下觀察細胞形態及染色變化。

2 結 果

2.1 BMSCs細胞形態及生長情況 本實驗選用1周齡SD大鼠，此年齡大鼠四肢長骨中骨髓豐富，BMSCs含量高，1只胎鼠的四肢長骨骨髓原液可分離得到1×106～2×106個細胞，培養2 d后貼壁率約60%。細胞增殖迅速，5 d后即出現融合現象，培養5～10 d后，細胞生長融合達90%，細胞形態發生較大變化，可見紡錘形和星形多突起樣生長，P0代第10天細胞的生長形態見圖1。此時可以進行傳代擴增，經蛋白酶消化后呈單個圓形細胞。長滿直徑10 cm培養皿后可得細胞量3×106～5×106個。傳到P5代后細胞仍然形態良好，生長速度未見明顯減慢，細胞的生長曲線見圖2。

2.2 流式細胞儀表型鑒定 流式細胞儀檢測結果顯示，分離培養的細胞表面抗原CD29陽性率89.4%，CD105陽性率46.0%，CD34陽性率3.3%，CD45陽性率2.5%（陽性率由儀器自動判斷顯示，圖3）。

圖3 流式細胞儀檢測結果

2.3 5-氮雜胞苷誘導分化后的細胞 5-氮雜胞苷誘導后繼續培養3周，部分細胞變為多角形，呈長梭形生長，胞膜清楚，無空泡，胞內可見趨于融合的多核肌管樣細胞結構，見圖4。

2.4 蛋白表達 未經5－氮雜胞苷誘導的P3代BMSCs在培養15d時，結蛋白和α－SMA兩種蛋白幾乎不著色，見圖5-1；誘導后1周的細胞質內有2種蛋白染色，細胞核染深色，細胞質內結蛋白染色為淡藍色，α-SMA染色為褐色，見圖5-2；誘導后3周的細胞2種蛋白染色較1周時明顯增強，見圖5－3。

圖4 誘導后3周肌樣細胞形態（×10）

圖5 免疫組化結果（×40）

3 討 論

BMSCs細胞體積小、核大、胞漿少，細胞器不發達，從骨髓提取時需注意與骨髓基質細胞（marrowderived stromal cells，MDSCs）的區分。BMSCs和MDSCs都起源于中胚層。MDSCs屬于骨髓造血系統細胞，有分化為造血細胞的潛能，但在自然情況下它無分化為造血細胞傾向。BMSCs并不表達造血細胞表面抗原，如前體細胞標記抗原CD34、成熟造血細胞標記抗原CD38、白細胞標記抗原CD45、淋巴細胞表面抗原CD11a和單核巨噬細胞表面抗原CD14，而只表達 CD29、CD44、CD105、CD166等基質細胞和間質細胞的特異性表面標記，尤其是CD105和CD166被作為BMSCs的特征性標志。本實驗分離得到的細胞CD29陽性率達89%，CD105陽性率達46%，而CD34陽性率只有3.3%，CD45陽性率2.5%，與相關文獻相近[3－4]，說明本研究獲取的細胞為純度較高的大鼠BMSCs。本實驗獲得的BMSCs表面的CD29和CD105陽性率有差異，可能來源于抗體孵育和測量時造成的部分失活而引起的實驗誤差，這是在合理范圍內的。

5－氮雜胞苷是一種去甲基化藥物，推測其可能與調控肌樣細胞分化的特異啟動子基因上的阻截蛋白結合，使DNA的胞嘧啶去甲基化，最終激活啟動肌細胞定向分化的調控基因，誘導BMSCs向肌樣細胞分化。有實驗研究表明，BMSCs的誘導分化程度與5－氮雜胞苷濃度和作用時間有關，在10μmol／L作用24 h誘導作用最強[5]。5-氮雜胞苷濃度低、作用時間短時，誘導分化不明顯；濃度超過20 μmol／L和作用時間超過48 h，則可引起細胞死亡脫落。

本研究結果表明，未經誘導的P3代BMSCs不表達結蛋白和α-SMA。經5－氮雜胞苷誘導后培養的BMSCs分別進行結蛋白和α-SMA免疫組織化學染色，1周時為弱陽性，3周時為陽性，表達逐漸增強，表明經過誘導后的細胞已向肌樣細胞分化。TGF-β也能誘導BMSCs向肌細胞分化[6]。有研究認為，5－氮雜胞苷誘導間充質干細胞分化為心肌樣細胞的作用較強，而向平滑肌細胞的誘導作用較弱[7]。本實驗誘導得到的肌樣細胞表達的結蛋白和α-SMA在骨骼肌和平滑肌中也都有表達，所以較難將其定性。經5-氮雜胞苷誘導后的BMSCs明顯表達肌樣特異性蛋白，說明干細胞具有定性分化能力，這種前體肌細胞經外界環境再刺激后，可能分化出3種不同的肌細胞。

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