應用Taqman－MGB探針法檢測地中海貧血Hb Westmead突變＊

陳文強，陳 萍，龐麗紅，李樹全，林偉雄，楊德寨

（1.廣西醫科大學醫學科學實驗中心，南寧530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院產前診斷中心，南寧530021）

地中海貧血（以下簡稱地貧）是一種常染色體遺傳慢性溶血性疾病，該病多見于我國廣東，廣西等地區。根據基因突變的不同，主要分為α地貧和β地貧兩大類。Hb Westmead突變屬于非缺失型地貧中的一種，可產生輕度不穩定的血紅蛋白變異體［1］。單純的Hb Westmead突變攜帶者沒有貧血的臨床表現，但是與攜帶有輕型地貧患者婚育，則有可能生下中間型α地貧患兒。為了準確、簡單、快速地診斷該病，本文應用Taqman－MGB探針技術，建立了Hb Westmead突變熒光探針檢測方法，檢測過程操作簡單、快速，檢驗結果準確、特異性高。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部病例來自在廣西醫科大學第一附屬醫院門診就診的患者，選擇平均紅細胞體積在70～80fl之間的患者共200例，其中，男96例，女104例。

1.2 方法

1.2.1 血液學分析 用血細胞自動分析儀（ACT5DF，美國Beckman）進行檢測，收集平均紅細胞體積（MCV）等數據。

1.2.2 DNA提取 自動核酸提取儀（Lab－Aid 820，廈門百維信）提取DNA，微量紫外分光光度計（NanoDrop ND－8000，美國Thermo）檢測DNA濃度。

1.2.3 引物設計與合成 設計正向擴增引物：W1：GCG CAG GAG GAA CGG CTA和反向擴增引物 W2：CGG CAC TGA CCC TCT TCT CT，擴增目標片段；合成兩條MGB探針M1：FAM－CAG GGA GGC GTG CA，M2：VIC－CAG GGA GGC CTG CA；檢測含α2珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突變，引物和探針由美國ABI公司合成。

1.2.4 實時定量PCR反應 PCR擴增體系總體積為25μL：其中 Master mix 12.5μL，20×Taqman genotype assay 1.25 μL，DNA模板1.0μL，加雙蒸水至25μL。實時定量PCR擴增條件：95℃預變性10min→ （95℃10s，60℃60s）共40個循環；在實時熒光定量PCR儀（7500Fast，美國ABI）進行擴增反應。反應結束后對擴增曲線進行分析，判定結果。

1.2.5 DNA 測序 設計上游引物：L1：5′－CCT GGG CCG CAC TGA CCC TCT T－3′。下游引物 L2：5′－GTC TGA GAC AGG TAA ACA CCT CCA T－3，擴增含目標基因第122位密碼子的α2珠蛋白基因片段，擴增產物長度為340bp。反應體系包括：10×Buffer 5μL，2.5mMol／L d NTPs 4μL，15 pmol／L引物1μL，1.0UTaq酶（大連寶生物），模板2.0μL，加雙蒸水至50μL。反應條件：預變性94℃5min，變性94℃30s，退火、延伸64℃90s，共30個循環，72℃延伸10min。經純化后使用BigDyeTM Terminator v3.1Ready Reaction Cycle Sequencing試劑盒在全自動測序儀（PRISM3730，美國ABI）上進行產物測序。

1.3 統計學處理 使用SPSS17.0軟件，利用Kappa分析比較兩種檢測方法檢測結果的一致性。

2 結 果

2.1 血常規情況 200例患者的RBC水平為（4.92±0.65）×1012／L，HB水平為（122.66±17.89）g／L，MCV 水平為（76.04±2.93）fl，MCH 水平為（24.91±1.42）pg。

2.2 Taqman－MGB探針法檢測Hb Westmead突變結果 在檢測200例患者中，發現Hb Westmead突變12例，其中，男5例，女7例，其余188例患者檢測結果為正常。在健康人標本檢測結果可見三條反應曲線，而Hb Westmead突變基因攜帶者標本的擴增曲線可見四條曲線，健康人和攜帶者擴增曲線的位置，形態有區別明顯。

2.3 基因測序法檢測Hb Westmead突變結果 基因測序法檢測結果見圖1，在200例患者中，其余188例患者檢測結果為正常，結果見圖1A，檢測出Hb Westmead突變12例，其中，男5例，女7例，結果見圖1B。

圖1 地貧Hb Westmead突變DNA測序結果

2.4 統計學分析結果 經Kappa分析，Kappa＝1，P＜0.01，兩種檢測方法的檢測結果一致，即對所研究對象同時用Taqman－MGB探針法和基因測序法檢測Hb Westmead突變發生率，統計結果表明兩種檢測方法對Hb Westmead突變的檢出率沒有差別。

3 討 論

Hb Westmead是一種非缺失型α地貧，是α2－珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突變所致的靜止性血紅蛋白變異體，具有輕度不穩定性。Hb Westmead突變基因攜帶者，臨床上沒有貧血、黃疸等表現，血常規檢測可以是正常或只有輕微改變，如血色素、MCV、MCH等指標輕微降低，比較容易出現漏診。Hb Westmead突變基因攜帶者可在感染、發熱或使用磺胺等氧化性藥物的情況下出現溶血，導致輕微的貧血［2］。本文中所發現的12例患者，均沒有貧血表現，而是在例行婚前，孕期體檢中發現MCV輕微降低，進一步做基因診斷而發現。

由于Hb Westmead是一種電泳靜止型的血紅蛋白變異體，因此各種酸性或堿性醋酸纖維膜電泳、垂直等電聚焦法均不能使之分離；高效液相色譜法進行血紅蛋白分析時也沒有特異性波峰出現。針對該異常血紅蛋白的特異性檢測方法是Fleming等使用的pH 6.4柱層析電泳法，他用這個方法從血紅蛋白中分離并發現了Hb Westmead［1］，另外，對該血紅蛋白的測定使用毛細管電泳法［3］，反相高效液相色譜法等方法［4］。對Hb Westmead的CD122（CAC→CAG）突變的基因診斷則使用PCR聯合StuI內切酶法［5］，溫度梯度凝膠電泳法［6］和反向斑點雜交等方法檢測該突變點，但這些方法操作步驟多，檢測周期長。本研究采用Taqman－MGB探針法直接探測PCR過程中熒光信號的變化，以獲得定性的結果，不需要PCR后處理或電泳檢測，檢測步驟簡單，檢測周期短，可在短時間內得出結果。本文200例標本用Taqman－MGB探針法檢測，結果和基因測序的結果一致，說明該方法具有較高的可靠性。同時該方法所設計的MGB探針結合在DNA雙螺旋內，使探針的結合穩定；其次MGB探針的較短，報告基團與淬滅分子在位置上很接近，這樣使得實驗的結果有較高的精確度；另外探針3C端結合了MGB，探針的Tm值提高，使突變與非突變模板間的Tm值差異增加，提高了檢測的特異性。綜上所述，Taqman－MGB探針法可以快速檢測Hb Westmead突變，結果穩定可靠，特異性高。

Hb Westmead在澳大利亞［1］、巴西［7］、老撾［8］及國內香港地區［9］均有個例報道，但病例報道數量不多。在廣西也有相關報道［10－11］，在本文中，檢測的200紅細胞體積輕微異常患者共發現12例Hb Westmead突變，發生率為6%，說明Hb Westmead突變在廣西有著比較高的基因攜帶率。在這12例患者中，均無明顯貧血癥狀，但當Hb Westmead復合東南亞α地貧時（HbH病；－－SEA／αWSα）可出現脾臟增大，輕度貧血等臨床癥狀［12］。因此，在產前優生遺傳咨詢時，對于一方已診斷輕型或中間型α地貧，另一方沒有貧血癥狀、但血常規有 MCV輕微降低的夫婦，注意需要進一步做Hb Westmead突變的基因分析，以免漏診，生下 HbH 病（－－SEA／αWSα）的患兒。

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