幽門螺桿菌對胃癌BGC－823細胞中Bcl－xl基因表達的影響及作用＊

吳 鶯，孫海波，艾寬寬，何亞龍，魏金文，徐 岷，周 紅

（1.江蘇大學附屬醫院消化科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學醫學基礎與醫學技術學院，江蘇鎮江212001）

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）與胃癌的發生密切相關，其致癌機制仍不十分明確［1］。體內及體外的研究顯示，Hp可以刺激胃上皮細胞的增殖［2］。Bcl－xl基因是一種抗凋亡基因，研究顯示，Bcl－xl基因在腫瘤的發生發展中扮演著重要的作用［3－4］。RNA干擾技術是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉錄后基因沉默現象。本研究用東亞型（W24）及西方型（11637）［兩種菌株均為cagA陽性（＋）菌株］Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞，探討Hp超聲裂解液對胃癌BGC－823細胞增殖以及胃癌BGC－823細胞中Bcl－xl基因mRNA表達水平的影響，設計Bcl－xl基因特異性shRNA沉默Bcl－xl基因的表達，從而抑制胃癌BGC－823細胞增殖，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細胞BGC－823細胞由江蘇大學生理教研室提供；東西方型Hp（均為cagA＋菌株）來源于江蘇大學附屬醫院消化科［5］。Hp培養相關材料試劑購于德國 Merck公司；Bcl－xl shRNA Plasmid（h）以及Bcl－xl單克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 BGC－823于含10%新生小牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2溫箱中培養。

1.2.2 Hp培養及菌體超聲裂解液的制備 將Hp接種于哥倫比亞固體瓊脂培養基，加入10%的新鮮羊血，在微需氧環境，37℃下培養，3d后收集細菌，經鑒定為Hp菌株，然后將Hp刮下后用PBS漂洗2次，懸于不含血清的DMEM培養液中，菌體懸液經超聲裂解后濃度調整為（1g／L），－20℃保存備用［6］。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 取1×103／mL細胞懸液接種于96孔培養板內，待細胞貼壁后吸去培養基，實驗組分別加入含10%的東亞型和10%的西方型Hp超聲裂解液的培養基，并設置5個平行孔；對照組為不含Hp的裂解液成分培養基，并設置5個平行孔；繼續培養24h。參照MTT步驟，于490 nm波長測定吸光度值（OD值）。細胞的增值率（%）＝OD（實驗組－對照組）／OD對照組×100%。

1.2.4 熒光定量PCR檢測Bcl－xl mRNA水平表達 取1×105／mL細胞懸液接種于6孔培養板內，37℃、5%CO2溫箱中培養，待細胞貼壁后，吸去培養基，實驗組分別加入含10%的東亞型和10%的西方型Hp超聲裂解液的培養基，對照組為不含Hp的裂解液成分培養基，繼續培養24h。提取胃癌BGC－823細胞總RNA，證實提取的總RNA可用（圖1）。按照逆轉錄試劑盒說明書，將細胞的總RNA逆轉錄成cDNA。引物的設計與合成：上游引物 P1：5′－TGG CAG CAG TAA AGC AAG－3′；下游 引物 P2：5′－CAT TTC CGA CTG AAG AGT GA－3′（GenBank登錄號：NM＿138578.1），引物由公司合成。引物的長度為137bp。反應體系參照說明書。內參為GAPDH，引物長度為496bp。每個反應至少重復3次。

圖1 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞24h后，細胞總RNA的凝膠電泳圖

1.2.5 細胞轉染 取每毫升3×105細胞懸液接種于6孔培養板內，培養使細胞達到90%～95%的融合。溶液1：在6孔培養板每孔加入無血清DMEM培養基240μL和10μL的脂質體2000（總體積250μL，溫育5min）；溶液2：Bcl－xl shRNA Plasmid DNA 2μg溶于250μL的無血清DMEM培養基中；空白照為250μL的無血清DMEM培養基；陰性對照為2μg Control shRNA Plasmid DNA溶于250μL的無血清DMEM培養基中。參照說明書轉染。轉然后繼續培養24～72h檢測轉染水平。

1.2.6 轉染水平檢測

1.2.6.1 熒光定量PCR檢測Bcl－xl mRNA水平表達 轉然后24h，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA進行熒光定量PCR檢測（方法如1.2.4）。

1.2.6.2 蛋白印跡法 提取轉染后72h的細胞的總蛋白，蛋白上樣量為10μL，將蛋白于Bio－Rad標記的轉印儀上轉移至PVDF膜上，BSA封閉，Bcl－xl單抗、山羊抗鼠IgG孵育，發光劑孵育5min后于成像系統上掃描，以β－actin為內參，測定其比值。

1.2.6.3 轉然后MTT法檢測細胞增殖 轉染24h后以每孔1×103個細胞接種于96孔培養板，每孔終體積為200μL。培養24h后換液開始實驗。分別在24、48h和72h3個時間段測OD。

1.3 統計學處理 用SPSS16.0統計軟件進行檢驗，實驗數據均以±s表示。多個均數間比較，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hp超聲裂解液促進胃癌BGC－823細胞增殖 與對照組相比，東亞型處理組細胞增值率為29.7%（P＜0.01），西方型處理組細胞增值率為18.7%（P＜0.01）；與西方型處理組相比，東亞型處理組細胞增值率為11%（P＜0.01）。見圖2。

圖2 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞24h后，MTT法檢測細胞增殖情況

圖3 Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞24h后，熒光定量PCR檢測細胞中Bcl－xl mRNA水平的表達

圖4 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝膠電泳圖

圖5 Bcl－xl shRNA轉染BGC－823細胞24h后，Bcl－xl mRNA的相對表達量（%）

2.2 Hp超聲裂解液可以上調BGC－823細胞中Bcl－xl mRNA水平的表達 與對照組相比，東亞型處理組細胞中Bcl－xl mRNA水平上調了2.39倍（P＜0.01），西方型處理組細胞中Bclxl mRNA水平上調了2.06倍（P＜0.01）；與西方型處理組相比，東亞型處理組細胞中Bcl－xl mRNA水平表達量更高（P＜0.05。見圖3、4。

圖6 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝膠電泳圖

圖7 Bcl－xl shRNA 轉染 BGC－823細胞72h后，Bcl－xl蛋白的相對表達量的變化

圖8 Bcl－xl shRNA 轉染 BGC－823細胞72h后，Bcl－xl蛋白的相對表達量的變化

圖9 Bcl－xl shRNA分別轉染BGC－823細胞24、48h及72h后，MTT法檢測BGC－823細胞的增殖情況

2.3 Bcl－xl shRNA 可以沉默Bcl－xl mRNA、蛋白的表達，并抑制BGC－823細胞的增殖 轉染24h后，Bcl－xl mRNA水平明顯的下調（圖5、6）。轉染72h后，Bcl－xl蛋白表達水平也明顯下調（圖7、8）。轉染24、48h和72h后，BGC－823細胞的增殖抑制率分別為7.5%、24.7%、53%（均為P＜0.01），見圖9。

3 討 論

Hp的毒力因子CagA蛋白與胃癌的發生密切相關［7－8］。CagA蛋白主要有東亞型和西方型2種類型。研究顯示，東亞型CagA＋Hp與胃癌的發生關系更密切［9］。在本研究中，分別用東亞型和西方型CagA＋Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞，與對照組相比，處理組細胞均出現增殖，且東亞型處理組細胞增殖更顯著，提示東亞型CagA＋Hp比西方型CagA＋Hp具有更強的生物活性。Bcl－xl是一種抗凋亡基因，在腫瘤的發生發展過程中起著重要的作用。在線粒體凋亡途徑中，Bcl－xl通過抑制線粒體細胞色素C的釋放，從而影響凋亡復合體的組裝而發揮抗凋亡作用；在細胞表面的死亡受體介導的凋亡途徑中，Bcl－xl通過阻礙死亡復合體（DISC）的組裝而發揮抗凋亡作用。Nardone等［10］臨床標本研究發現，Hp陽性患者中Bcl－xl基因的表達顯著高于 Hp陰性的患者中Bcl－xl基因的表達。Yang等［11］臨床標本研究發現，CagA＋Hp患者中Bcl－xl基因的表達顯著高于CagA－Hp的患者中Bcl－xl基因的表達。這說明Hp與Bcl－xl基因的表達有一定的相關性，且與CagA毒力因子有關。本研究分別用東亞型和西方型CagA＋Hp超聲裂解液處理胃癌BGC－823細胞，與對照組相比，處理組細胞均出現增殖，細胞中Bcl－xl mRNA的表達均出現上調，這提示Bcl－xl與胃癌BGC－823細胞的增殖有一定相關性。RNA干擾技術已廣泛應用于腫瘤的治療研究中［12－13］。許多體外研究也表明，Bcl－xl特異性干擾RNA可以抑制人類腫瘤細胞的增殖［14－15］。因此本研究用Bcl－xl特異性干擾RNA轉染胃癌BGC－823細胞，觀察其對胃癌BGC－823細胞的增殖的影響。將特異性Bcl－xl shRNA質粒轉染胃癌BGC－823細胞，結果胃癌BGC－823細胞中Bcl－xl mRNA的表達以及蛋白的表達均顯著降低，并且胃癌BGC－823細胞的增殖作用也有不同程度的降低。這說明胃癌BGC－823細胞的增殖與Bcl－xl基因的表達確有一定相關性。

本研究結果顯示，Bcl－xl基因在Hp感染相關性胃癌中扮演著重要的作用，尤其在CagA＋Hp感染相關性胃癌中所起的作用更顯著，Bcl－xl特異的干擾RNA可以抑制胃癌shRNA細胞的增殖。因此，Bcl－xl特異的干擾RNA或許可以作為治療胃癌的方法。

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