急性染鉛對大鼠海馬CREB、c－FOS蛋白表達的影響＊

包翠芬，趙 艷，宋慧娟，張尤新

（遼寧醫學院：1.科學實驗中心；2.基礎學院生物化學教研室，遼寧錦州121001）

重金屬鉛具有較強的神經親和性，研究表明，鉛暴露可導致兒童學習記憶認知能力改變及智力障礙。鈣－鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）信號通路在學習記憶方面發揮著重要作用，急性鉛中毒可能通過抑制該通路中CaMKⅡ活性從而影響下游信號分子，造成對學習記憶功能的損傷，但是其機制目前還不完全清楚［1－4］。本實驗通過使用CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛對大鼠海馬腦片進行處理，通過檢測其下游信號分子cAMP反應元件結合蛋白質（CRE binding protein，CREB）、c－FOS的表達來探明急性染鉛對Ca2＋／CaM－CaMKⅡ 信號轉導通路的影響，進一步探討CaMKⅡ是否在大鼠海馬急性鉛中毒中的信號轉導具有開關作用，以闡明鉛對學習記憶影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠，生后30d，雌雄各半（由遼寧醫學院實驗動物中心提供），動物合格證號：SYXK（遼）2003－0011；兔抗大鼠CREB、c－FOS多克隆抗體，購于Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗，購于北京中山金橋公司；醋酸鉛購于沈陽化學試劑廠；PowerPac 3000電泳儀（美國Bio－Rad公司）；Trans－blot SD半干轉膜儀（美國 Bio－Rad公司）；其余試劑由遼寧醫學院科學實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養腦片樣品制備 取生后30d大鼠，頸脫臼處死后迅速取出大腦海馬，放入4℃的人工腦脊液（ACSF）內，將其橫切為350μm左右的腦片，于六孔培養板中培養。培養過程中連續通入流速1mL／min的混合氣體（95%O2＋5%CO2），溫度32.5～33.5℃［5］。

1.2.2 急性染鉛樣品制備 上述樣品穩定培養2h后，分為對照組（n＝5）和染鉛組（n＝35）：染鉛組加入20μmol／L醋酸鉛，分別于注入0、3、7.5、15、30、60、120min收集腦片，對照組繼續采用ACSF培養并與染鉛組同時收集腦片［5－6］。

1.2.3 CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛處理樣品制備 上述樣品穩定培養2h后，更換培養液，按培養液的種類分為4組（n＝5），（1）對照組：ACSF液；（2）激活劑組：含谷氨酸的 A CSF液（谷氨酸終濃度為5μmol／L）；（3）抑制劑組：含 K N－93的ACSF液（KN－93終濃度為100μmol／L）；（4）染鉛組：含谷氨酸及醋酸鉛的ACSF液（谷氨酸、醋酸鉛終濃度分別為5、20 μmol／L）。繼續培養30min后收集腦片［5］。

表1 改變CaMKⅡ活性對CREB、c－FOS活性及表達的影響（±s，n＝3）

表1 改變CaMKⅡ活性對CREB、c－FOS活性及表達的影響（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

組別 p－CREB CREB p－c－FOS c－FOS對照組 0.292 5±0.003 6 0.532 5±0.025 2 0.254 6±0.026 70.407 0±0.025 5激活劑組 0.431 1±0.008 7＊ 0.514 0±0.037 8 0.395 5±0.033 2＊ 0.413 2±0.028 0抑制劑組 0.342 3±0.015 5＊ 0.558 4±0.038 6 0.104 8±0.010 6＊ 0.405 0±0.024 5染鉛組 0.235 1±0.028 6＊ 0.561 9±0.029 7 0.136 6±0.012 1＊0.411 5±0.026 4

1.2.4 免疫印跡法測定CREB、c－FOS的活性 將收集的海馬腦片樣品立即放入4℃裂解緩沖液中，靜止0.5h后超聲粉碎組織，12 000r／min，4℃離心20min，取上清液。采用二喹啉甲酸法測定蛋白含量；按所測濃度稀釋樣品。取適量稀釋后樣品加入電泳槽進行電泳，轉膜，半干轉印，5%脫脂奶粉封閉后。分別加入一抗（兔抗大鼠磷酸化及非磷酸化CREB、c－FOS抗體，稀釋度為1∶1 000）4℃過夜；TBST緩沖液洗脫后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體孵育1h，TBST緩沖液洗脫；ECL發光顯色。采用β－actin作為內參。掃描電泳條帶，采用UVP軟件測定蛋白目的條帶的灰度值。待測蛋白質含量＝目的條帶灰度／內參條帶灰度。

1.2.5 統計學處理 以SPSS 13.0軟件統計對實驗數據經內參校正后進行方差分析。所有數據均以±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 急性染鉛對大鼠海馬腦片CREB、c－FOS活性的影響免疫印跡結果顯示，采用內參校正后，對照組CREB、c－FOS活性隨時間延長無顯著性變化；而染鉛組CREB、c－FOS活性隨時間延長呈顯著性降低趨勢，見圖1。

圖1 急性染鉛對大鼠海馬CREB、c－FOS活性的影響

圖2 Western blot測定CREB、c－FOS活性及表達

2.2 谷氨酸、KN－93、鉛對CREB、c－FOS表達的影響 谷氨酸通過活化CaMKⅡ蛋白使磷酸化CREB、c－FOS的活性分別增強了47%、54%，而對非磷酸化CREB、c－FOS的表達無顯著性影響；采用 KN－93抑制CaMKⅡ的活性使CREB、c－FOS活性分別降低了20%～59%，而對總量CREB的表達無顯著性影響；鉛能夠拮抗谷氨酸的作用，使谷氨酸誘導的CREB、c－FOS活性升高分別降低了45%～47%，而對總量CREB表達無顯著性影響，見表1、圖2。

3 討 論

環境中的鉛是影響嬰幼兒智力發育、兒童學習記憶功能的神經毒性物質之一，鉛中毒的作用機制研究一直是防治鉛中毒領域的熱點問題。目前研究表明，突觸傳遞在學習記憶過程中發揮著重要的作用，而某些蛋白激酶參與了突觸傳遞過程。其中Ca2＋／CaM－CaMKⅡ是突觸后傳遞的主要通路之一。當大腦海馬CA1區受到強烈刺激后，立即傳導至神經使樹突的谷氨酸受體激活，進而使與谷氨酸受體偶聯的Ca2＋通道開放，引發Ca2＋內流及谷氨酸的釋放，導致胞內Ca2＋濃度升高，使CaMKⅡ的Thr－286磷酸化導致其被激活。這種磷酸化能夠使其在細胞內Ca2＋濃度下降的情況下仍然保持活性，此活化過程被認為是學習記憶的分子基礎［7－8］。本研究采用體外應用激活劑（谷氨酸）和抑制劑（KN－93）以改變培養腦片中CaMKⅡ活性，同時采用醋酸鉛處理腦片，以觀察其對下游信號分子活性的影響［9］。

研究表明，CREB和c－FOS是 Ca2＋／CaM－CaMKⅡ下游通路的重要因子。當突觸活化產生的Ca2＋內流激活腺苷酸環化酶，催化ATP合成cAMP，進一步激活蛋白激酶A，使其催化亞基進入核內促使CREB磷酸化，形成二聚體與cAMP反應元件結合，活化下游分子。而c－FOS作為第三信使，通過激活異源二聚體激活蛋白－1的結合位點從而完成CREB下游因子的信號轉導［10－13］。本研究結果顯示，大鼠海馬腦片培養時，激活劑組活化的CREB、c－FOS表達量與對照組比較顯著增強，而抑制劑組及染鉛組活化的CREB、c－FOS的表達則顯著降低，此結果提示急性鉛中毒對Ca2＋／CaM－CaMKⅡ信號轉導通路的影響可能通過抑制CaMKⅡ的活性，影響某些蛋白激酶的激活狀態，從而降低下游信號分子CREB、c－FOS的磷酸化水平，改變CREB、c－FOS調節基因轉錄的能力，干擾基因表達和蛋白質的合成，導致學習記憶功能障礙［14］。研究表明，Ca2＋／CaM－CaMKⅡ通路在鉛中毒導致學習記憶損傷中發揮著重要的作用，可能作為開啟和關閉下游信號轉導通路的靶點，對該通路的深入研究可能為揭示鉛神經毒機制提出新的思路，為防治鉛中毒提供新的理論依據和線索。

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