他克莫司對腎小管上皮細胞轉分化早期CTGF、VEGF表達的影響

閔亞麗，趙冬慧，于 黔

（貴陽市第一人民醫院腎內科 550004）

他克莫司對腎小管上皮細胞轉分化早期CTGF、VEGF表達的影響

閔亞麗，趙冬慧，于 黔

（貴陽市第一人民醫院腎內科 550004）

目的探討不同劑量的他克莫司（FK506）對腎小管上皮細胞（HKC）轉分化的作用及其對早期結締組織生長因子（CTGF）、血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法以體外培養的HKC為研究對象，分4組：（1）對照組；（2）轉化生長因子－β1（TGF－β1）（8ng／mL）組；（3）FK506（10、30、60ng／mL）組；（4）TGF－β1（8ng／mL）加 FK506（10、30、60ng／mL）組。應用形態學、免疫組化技術、和半定量反轉錄PCR（RT－PCR）觀察FK506對TGF－β1誘導的HKC轉分化的作用及對α－SMA、CTGF、VEGF表達的影響。結果與對照組比較，48h后TGF－β1組HKC細胞呈現出長梭形外觀，α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）、CTGF、VEGF的表達明顯增多（P＜0.01），FK506組α－SMA、VEGF及CTGF的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。TGF－β1加FK506組比TGF－β1組α－SMA、VEGF及CTGF隨FK506的濃度增加表達明顯降低（P＜0.05）。結論FK506對TGFβ1誘導的腎小管上皮細胞轉分化早期可能通過下調VEGF、CTGF的表達起抑制作用。

他克莫司；腎小管；細胞轉分化；血管內皮生長因子類；結締組織生長因子

腎間質纖維化是指由多種原因引起的細胞外基質成分在腎間質內過度沉積，是各種慢性腎臟疾病進行性發展的共同最終通路［1］。由于腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化（EMT）在腎間質纖維化變化中的重要性已經為人們認識，所以積極探索有效的預防、抑制甚至逆轉EMT的發生對治療腎間質纖維化進展有重要意義［2］。轉化生長因子－β1（TGF－β1）是非常重要的促纖維化因子，結締組織生長因子（CTGF）是TGF－β1發揮作用的下游效應因子。VEGF是血管新生的主要促進因子［3］。大量表達的VEGF可加重平滑肌細胞增生及血管壁增厚，促進細胞外基質成分在內皮細胞外堆積，導致腎臟纖維化。FK506臨床主要應用于器官移植排斥反應等的治療，近年開始用于免疫性腎臟疾病、結締組織病等的治療，但FK506對腎小管上皮細胞轉分化中的作用如何研究甚少。本實驗的目的在于觀察FK506對TGF－β1誘導的體外培養的腎小管上皮細胞轉分化的早期影響，并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人類腎小管上皮細胞購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 試劑 他克莫司由安斯泰來公司惠贈；DMEM／F12購自美國Gibico公司；0.25%胰蛋白酶購自Thermo公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、胎牛血清（FBS）購自北京中山公司；人重組TGF－β1購自Peprotech公司；兔抗人CTGF多克隆抗體，兔抗人VEGF多克隆抗體購自山海天呈公司；TRIzol購自Invitrogen公司；RT－PCR逆轉錄試劑盒購自Formentas公司；CTGF、VEGF及α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）引物合成（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 HCK細胞形態學觀察 HKC細胞培養于DMEM／F12，5%FBS、100U／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素培養基中，于37℃、5%CO2培養箱中孵育，細胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化。將細胞按照1×106C個／孔接種于孔板中，細胞生長至70%～80%，換用無血清培養基同步化24h。以未處理的 HKC為對照組，以 TGF－β1（8ng／mL）單獨處理48h的HKC為TGF－β1組，以不同濃度FK506單獨處理細胞48h為FK506（10、30、60ng／mL）組，以8ng／mL TGF－β1加不同濃度的FK506共同處理細胞48h為 TGF－β1加 FK50（10、30、60 ng／mL）組。然后每4小時在倒置顯微鏡下觀察1次細胞形態。48h后拍照，收集爬片及細胞分別進行以下實驗，所有實驗重復3次。

1.3.2 細胞免疫組化方法測定各組 HKC細胞CTGF及VEGF蛋白的表達 獲得細胞爬片后，以冷PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20min后吸干，加入PBS水化。0.1%Tritonx－100室溫30min，0.3%H2O2室溫20min封閉內源性過氧化物酶，5%山羊血清血清室溫30min，封閉非特異性抗原，分別加兔抗人CTGF及VEGF多克隆抗體（1∶200、1∶150）4℃過夜。再分別與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗37℃孵育40min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、樹脂封片；用PBS替代一抗做空白對照，顯微鏡下觀察并照相。

1.3.3 RT－PCR測定細胞mRNA水平的表達 按TRizol說明書提取細胞中的總RNA，紫外分光光度機對RNA定量，用Oligo（dT）引物進行樣品RNA（200ng）的反轉錄，得到cDNA。α－SMA上游5′－GCT CAC GGA GGC ACC CCT GAA－3′下游5′－CTG ATA GGA CAT TGT TAG CAT－3′。CTGF上游5′－CGG CTT ACC GAC TGG AAG AC－3′下 游 5′－CGT CGG TAC ATA CTC CAC AG－3′。VEGF上游5′－ACC ATG AAC TTT CTG CTG TC－3′下游5′－TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC－3′。GAPDH 上 游 5′－CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG－3′下游5′－GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G－3′（上海生工）。Real－Time PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5μL；MgCl2溶液3μL；dNTP混合液3μL；Taq聚合酶3 μL；20μmol／L的PCR特異性上游引物0.5μL；20μmol／L的PCR特異性下游引物0.5μL；cDNA 2μL；加水至總體積為25 μL。反應體系置于Real－Time PCR儀上。分別反應條件：（1）94℃變性3min；35個PCR循環：94℃變性30s；58℃退火30 s；72℃延伸60s。（2）95℃變性1min；45個PCR循環：95℃變性10s；60℃退火1s；72℃延伸10s。（3）94℃變性3min；35個PCR循環：94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45 s。（4）94℃變性3min；35個PCR循環：94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠100V 50min，結果用凝膠成像系統及分析軟件進行電泳條帶分析，α－SMA基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為α－SMA基因校正后的相對含量。CTGF基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為CTGF基因校正后的相對含量。VEGF基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為VEGF基因校正后的相對含量。

1.4 統計學處理 用SPSS 12.0軟件對結果中的數據進行統計學處理，所有數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態的觀察 對照組及FK506各濃度組HKC細胞生長6d后，形成融合的單層上皮細胞，呈橢圓形的鋪路石樣的形態學特征。加TGF－β1培養48h后細胞呈現成纖維細胞樣梭形外觀，且細胞生長排列紊亂，細胞發生了轉分化。同時加入不同劑量的FK506和TGF－β1共同作用組，觀察到部分細胞形態維持正常的細胞形態，仍存在部分發生形態改變的細胞，似成纖維細胞樣。

2.2 FK506對α－SMA mRNA表達的影響 對照組少量表達α－SMA mRNA，不同濃度FK506作用48h后，較對照組α－SMA mRNA表達量變化差異無統計學意義（P＞0.05），TGF－β1干預48h后，較對照組α－SMA mRNA表達量顯著上升（P＜0.05），FK506可以減少 TGF－β1誘導的 α－SMA mRNA表達，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖1、表1。

2.3 FK506對CTGF及VEGF表達的影響

2.3.1 細胞免疫組化SP法檢測CTGF及VEGF表達的變化將每張片在×100高倍鏡下，順時針盲法計算15個高倍視野中，陽性細胞百分率＝總陽性細胞數／總細胞數，每組實驗重復3次。對照組和FK506各濃度組CTGF陽性細胞占總HKC細胞的面積比值均很低（3.21%～4.13%），各組之間差異無統計學意義（P＞0.05），TGF－β1組見大量細胞質中呈棕黃色，為CTGF表達陽性，陽性細胞占總HKC細胞的面積比值是15.42%，與對照組和FK506各濃度組差異有統計學意義（P＜0.05），與 TGF－β1 組 比 較，加 入 FK506（10、30、60 ng／mL）共同作用48h后，CTGF陽性細胞占總HKC細胞的面積比值分別為11.83%、9.25%、6.54%，呈劑量依賴性（P＜0.05）。見封3圖2。對照組VEGF陽性細胞占總HKC細胞的面積比值7.54%，FK506各濃度組（7.2%～7.6%）與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），TGF－β1組見大量細胞胞質中呈棕黃色，為VEGF表達陽性，陽性細胞占總HKC細胞的面積比值是23.07%，與對照組和FK506各濃度組差異有統計學意義（P＜0.01），與 TGF－β1組比較，TGF－β1加 FK506（10、30、60ng／mL）組作用48h后，VEGF陽性細胞占總 HKC細胞的面積比值分別為17.28%、14.25%、10.21%，呈劑量依賴性（P＜0.05）。見封3圖3。

2.3.2 RT－PCR定量檢測 對照組少量CTGF mRNA的表達，TGF－β1干預48h后，較對照組CTGF mRNA表達量顯著上升（P＜0.05），FK506各濃度組作用48h后，較對照組CTGF mRNA表達量差異無統計學意義（P＞0.05），但 TGF－β1加FK506（10、30、60ng／mL）組作用48h后可減少 TGF－β1誘導的CTGF mRNA表達，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖4、表1。

表1 FK506對各組細胞α－SMA mRNA、CTGF mRNA及VEGFF mRNA含量的變化（±s，%，n＝3）

表1 FK506對各組細胞α－SMA mRNA、CTGF mRNA及VEGFF mRNA含量的變化（±s，%，n＝3）

△：P＜0.05，與TGF－β1組比較；＃：P＜0.01，與對照組比較。

組別α－SMA mRNA CTGF mRNA VEGF mRNA對照組0.187±0.037 0.543±0.001 0.495±0.734 FK506 10ng／mL組 0.178±0.033 0.512±0.011 0.485±0.070 FK506 30ng／mL組 0.180±0.041 0.489±0.002 0.535±0.021 FK506 60ng／mL組 0.175±0.037 0.468±0.095 0.491±1.027 TGF－β1組 1.199±0.200＃ 1.877±0.047＃ 1.555±0.043＃TGF－β1＋FK506 10ng／mL組 0.666±0.063△ 0.702±0.045△ 0.936±1.002△TGF－β1＋FK506 30ng／mL組 0.465±0.114△ 0.672±0.017△ 0.688±2.021△TGF－β1＋FK506 60ng／mL組 0.317±0.023△ 0.606±0.022△ 0.442±1.030△

對照組有基礎量VEGF mRNA的表達，TGF－β1干預48h后，對照組VEGF mRNA表達量明顯上升（P＜0.05），不同濃度FK506作用48h后，較對照組VEGF mRNA表達量差異無統計學意義（P＞0.05），但 TGF－β1加 FK506（10、30、60ng／mL）組作用后可減少TGF－β1誘導的 VEGF mRNA表達，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖5、表1。

圖1 RT－PCR測定不同組α－SMA及內對照GAPDH的mRNA表達

圖4 RT－PCR測定不同組CTGF及內對照GAPDH的mRNA表達

圖5 RT－PCR測定不同組VEGF及內對照GAPDH的mRNA表達

3 討 論

大量研究已證實，在腎臟中TGF－β1可以活化成纖維細胞、促進小管上皮細胞轉分化、刺激ECM合成，使腎小管上皮細胞表型發生改變，失去表達細胞角蛋白，鈣粘蛋白等上皮細胞標記抗原，開始表達肌成纖維細胞標志物如α－SMA［4－5］。本實驗使用TGF－β1作為直接的刺激因子，對 HKC作用48h后，細胞拉長、肥大呈現成纖維細胞樣梭形外觀，且細胞生長排列紊亂。CTGF是TGF－β1發揮致纖維化作用的下游效應因子，TGF－β1可通過Ⅰ型轉化生長因子β受體（TβRI）／激活素受體樣激酶5（ALK－5）依賴Smad2信號途徑促進CTGF的表達。CTGF是TGF－β1的正反饋因子，放大TGF－β1的作用，而不影響其抗炎和免疫調節的作用，是一個更加理想的抗纖維化靶點［6－7］。

VEGF是維持血管內皮細胞生存、再生及其功能的重要因子［8］。在生理狀態下，腎臟有基礎量的VEGF的表達，對維持腎血管結構及正常生理功能是必需的［9］。大量表達的VEGF可介導腎小球系膜細胞和腎小球足突細胞產生細胞外基質而參與腎小球硬化的發生［10－11］，增加腎小球濾過屏障的通透性、使多種炎癥因子滲出和分泌，加劇炎性反應［12］，促進腎臟纖維化。在近來的研究中，TGF－β1與VEGF關系的研究也取得了顯著進展。TGF－β1可能通過蛋白激酶C途徑上調近端小管上皮細胞VEGF的表達，增加單核細胞的趨化作用加重平滑肌細胞增生及血管壁增厚，管腔狹窄及閉塞等引起腎血流量減少，使毛細血管袢及管周毛細血管數量增加，毛細血管球通透性增加，促進細胞外基質成分在內皮細胞外堆積，促進炎細胞在間質的浸潤，導致腎臟纖維化［13］。Kang等［14］在5／6腎切除大鼠慢性腎衰模型中觀察到早期VEGF明顯增加，隨后隨著腎小球VEGF表達下降，腎小球毛細血管損傷越重，腎小球硬化程度也越重。最近有研究報道VEGF可促進糖尿病小鼠腎小球新生血管生成，VEGF表達上調與糖尿病腎臟病變密切相關［15］。

本實驗觀察到，TGF－β1作用48h后CTGF及VEGF表達明顯增加，說明早期CTGF、VEGF加重了TGF－β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化。TGF－β1及FK506共同作用48h檢測到CTGF、VEGF mRNA均明顯下調，說明在TGF－β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化的早期FK506下調CTGF、VEGF表達，抑制了腎間質纖維化的進展，且呈劑量依賴性。隨著TGF－β1作用時間的延長，在慢性腎功能損傷的后期CTGF及VEGF的變化，及FK506對其的作用，在今后的實驗中會進一步探討。

綜上所述，FK506可以抑制TGF－β1介導的腎小管上皮細胞致纖維化作用，其作用可能為下調轉分化早期CTGF及VEGF的表達，保護腎組織血管床，維持腎小管上皮細胞正常的功能，為FK506臨床上早期應用于慢性腎纖維化的防治提供了一定的理論依據。

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Effects of Tacrolimus on transdifferentiation and CTGF，VEGF early expression of human renal tubular epithelial cells

Min Yali，Zhao Donghui，Yu Qian
（Department of Nephrology，First People′s Hospital of Guiyang City，Guiyang，Guizhou550004，China）

ObjectiveTo explore different doses of tacrolimus（FK506）to renal tubular epithelial cells（HKC）transdifferentiation and its early action on connective tissue growth factor（CTGF），vascular endothelialgrowth factor（VEGF）expressing change.MethodsThe human kidney cells（HKC）were cultured for 48hours in different conditions：（1）Serum free as control，（2）Treated with TGF－β1（8ng／mL）；（3）Treated with FK506at different concentration（10，30，60ng／mL）；（4）Treated with FK506at different concentration（10，30，60ng／mL）plus TGF－β1（ng／mL）.The expression ofα－SMA was assessed with RT－PCR，The expression of CTGF，VEGF was assessed with RT－PCR and immunohistochemistry after 48hours.ResultsCompared with the control group，The expression of CTGF，VEGF andα－SMA mRNA was markedly increased in HCK cultured with TGF－β1group（P＜0.05），which were suppressed significantly in HKC cultured with TGF－β1plus FK506group（P＜0.05）.ConclusionThe inhibition of FK506on transdifferentiation of tubular epithelial cells may be related to the down－regulation of VEGF，CTGF.

tacrolimus；kidney tubules；cell transdifferentiation；vascular endothelial growth factors；connective tissue growth factor

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.32.019

A

1671－8348（2012）32－3401－03

2012－04－07

2012－08－13）

·基礎研究·