4－羥基壬烯醛在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達＊

謝 姝，周從陽，李 凡，湯旭惠

（1.江西省人民醫院急診科，南昌330006；2.南昌大學第一附屬醫院急診科，南昌330006）

4－羥基壬烯醛在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達＊

謝 姝1，周從陽2△，李 凡1，湯旭惠1

（1.江西省人民醫院急診科，南昌330006；2.南昌大學第一附屬醫院急診科，南昌330006）

目的觀察百草枯（PQ）中毒大鼠肺組織中4－羥基壬烯醛（4－HNE）的表達。方法將48只SD大鼠按隨機數字表法分為A、B兩組，每組24只。B組PQ灌胃（80mg／kg）染毒建立SD大鼠肺損傷模型，A組等量生理鹽水灌胃。灌胃后12、24、48、72h觀察兩組大鼠肺組織病理改變及檢測肺組織中4－HNE表達。結果肺組織的病理變化：A組無明顯變化；B組肺泡毛細血管擴張，伴彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷，肺泡腔內炎性細胞浸潤。4－HNE在肺組織中的表達：B組明顯高于A組（P＜0.01）。結論PQ中毒時4－HNE表達增強，4－HNE可能為PQ中毒大鼠的肺損傷主要標志之一。

百草枯；4－羥基壬烯醛；SD大鼠

百草枯（paraquat，PQ）是一種廣泛應用的高效除草劑，口服吸收快，對人、畜有極高的毒性［1］。PQ進入人體后可致多器官出現損傷，其中毒的特征性改變是早期的急性肺損傷和晚期的肺纖維化［2］。患者多死于呼吸衰竭，病死率高達85%以上［3］。目前認為其主要中毒機制為氧化損傷。為進一步探明其中毒機制，本實驗通過復制大鼠PQ急性中毒模型，觀察PQ中毒后肺組織中4－羥基壬烯醛（4－HNE）的表達，為進一步探明PQ中毒機制提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD大鼠48只，體質量（220±40）g，雌雄不限，購自南昌大學醫學院動物科學部，標準喂養。采用隨機數字表法，分為兩組：對照組（A組），PQ染毒組（B組），每組24只。實驗參照謝仰民等［4］PQ染毒法建立急性肺損傷模型。B組PQ 80mg／kg一次性灌胃染毒，A組等量無菌生理鹽水灌胃。于染毒12、24、48、72h4個時間點，分別取 A、B組各6只，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3mL／kg麻醉后腹主動脈放血處死。

1.2 觀察指標 觀察大鼠肺組織病理改變：按預定時間處死大鼠，肉眼觀察大鼠肺組織，并取左肺下葉予10%甲醛固定，石蠟包埋后進行肺組織病理性觀察。觀察大鼠肺組織4－HNE表達：按預定時間處死大鼠，取左肺下葉予10%甲醛固定，石蠟包埋后進行免疫組化觀察肺組織4－HNE的表達。

1.3 試劑 主要試劑為20%PQ水劑（上海先正達公司）。一抗：兔抗大鼠4－HNE多克隆抗體（美國阿爾法診斷公司）。二抗：聚合HRP標記抗兔（武漢博士德公司）。免疫組化酶底物顯色劑：DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司）。復染劑：蘇木素（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.4 統計學處理 所有數據采用SPSS17.0統計軟件分析。數據均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和χ2檢驗，比較各組差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 染毒72h無大鼠死亡。A組大鼠全部活動敏捷，進食、進水正常，呼吸正常，毛發光潔。B組大鼠多在染毒1～2h內即出現明顯的中毒表現。具體表現為進食、進水量明顯減少或不進食進水，精神差，反應遲鈍，呼吸頻率加快，活動少，靜伏，易捕捉，毛發蓬松，口唇發紺，少數從口鼻流出血性泡沫狀分泌物。并在染毒24～72h表現最明顯。

2.2 兩組大鼠肺組織4－HNE表達情況 A組大鼠不表達或微量表達。B組大鼠在中毒后的12h表達即開始增多，48h達高峰，72h表達仍高，但較48h下降。與A組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1，封2圖1。

2.3 兩組大鼠肺組織病理改變 A組各時間點比較均無明顯差異，肉眼見肺組織回縮良好，呈均勻粉紅色，胸腔未見滲出液。光鏡下（OLYMPUS BX40型顯微鏡）見肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內無炎性細胞浸潤，有少許紅細胞。B組肉眼見肺組織回縮不良，體積明顯增大，可見大片狀出血；光鏡下見染毒12h后肺泡毛細血管擴張，毛細血管內皮細胞腫脹、細胞間隙增寬，血漿蛋白質沉積，氣管和血管周圍不同程度水腫，伴彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷，部分有透明膜形成，肺泡腔內有大量炎性細胞浸潤，肺泡上皮細胞退行性變，并隨時間的推移而加重。見封2圖2。

表1 肺組織中4－HNE表達變化±s，n＝24）

表1 肺組織中4－HNE表達變化±s，n＝24）

＃：P＜0.01，與 A組比較。

組別12h 24h 48h 72h A 組 7.00±1.549 7.67±1.862 7.00±1.414 7.33±1.966 B組 203.33±21.556＃ 418.33±43.228＃ 908.17±46.769＃ 801.50±47.247＃

3 討 論

PQ作為一種除草劑，近年來應用廣泛，隨之而來的中毒事件日趨增多。PQ中毒可導致全身多器官受損，其致病機制有多方面。研究表明PQ主要中毒機制是對機體氧化－還原系統的破壞和細胞內的氧化應激反應［5］。其中核因子－κB在急性損傷中起一定作用［6］。也有研究發現PQ中毒大鼠腎組織Livin蛋白及Caspase 3表達增加，從而推測細胞凋亡參與了PQ中毒后腎損傷的過程［7］。肺是PQ中毒的主要靶器官，早期可發生急性肺損傷，晚期則出現肺纖維化［8］。研究發現，PQ進入機體后被肺泡上皮2型細胞、1型細胞和氣管的Clara細胞主動攝取到細胞內，經過還原型輔酶Ⅱ（NADPH）還原形成自由基，然后與分子氧反應生成聯吡啶陽離子和超氧陰離子，后者歧化形成H2O2，再在Fe2＋作用下形成高活性自由基如OH－，從而誘導脂質過氧化反應，引起組織細胞尤其是肺組織的氧化性損傷。同時，NADPH的大量消耗，導致機體內許多需要NADPH參與的生化反應無法進行，進一步加重細胞損傷［9－10］。

脂質過氧化反應主要分解為醛基產物，后者能與體內的許多帶氨基、巰基官能團的物質如蛋白質、氨基酸、磷脂、DNA、膠原纖維、彈性纖維等發生反應，降低其功能，干擾細胞的正常功能活動，損傷細胞組分而致病。醛基產物中最主要的就是4－HNE和丙二醛（MDA）［11］。目前關于百草枯中毒后機體MDA含量變化的研究很多，有動物實驗發現PQ染毒后大鼠血清中 MDA含量顯著高于對照組［12］。宋愛麗［13］救治72例PQ中毒患者發現其血清中MDA含量增加，以24～48h最明顯。有報道新生小鼠缺血缺氧后腦組織4－HNE表達升高［14］。目前文獻報道4－HNE在肺部疾病的發生發展還很少。尤其4－HNE在PQ中毒后機體損傷中的研究未見報道。4－HNE來源于ω6多不飽和脂肪酸，研究發現9（S）氫化過氧十八碳烯酸［9（S）－HPODE］通過3個步驟降解形成 HNE［15］。哺乳動物生理條件下主要通過谷胱甘肽直接和4－HNE反應形成復合物而排出體外。4－HNE對機體損害與其濃度有關，100μmol／L以上能導致急性的細胞毒性反應而加速細胞死亡，1～20 μmol／L范圍內時能抑制DNA和蛋白質的合成、激發磷脂酶A2、抑制c－myc表達，而低于0.1μmol／L時，對生物體具有生理意義。故4－HNE含量的變化可以反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力。近年來有人通過用4－HNE刺激支氣管上皮細胞發現4－HNE可通過激活ERK1／2傳導路徑來增強磷酸化，進而影響下游轉錄因子活性，產生一系列生物活性產物，引起炎性改變［16］。還有研究發現吸煙會引起大鼠氣道上皮細胞4－HNE表達增加，且隨吸煙時間延長而表達水平升高［17］。于亮等［18］研究還發現紅霉素、銀杏內酯B能減少4－HNE引起的支氣管上皮細胞IL－8的合成，從而減輕炎性反應。本實驗通過PQ一次性灌胃大鼠，成功復制了PQ中毒大鼠肺損傷模型，觀察到與對照組相比，PQ染毒組大鼠肺組織4－HNE表達明顯增強，12h即開始，48h達高峰，表明PQ中毒引起肺損傷的同時可誘導4－HNE的表達增強。關于有效減輕4－HNE引起的機體損傷的治療措施目前報道較少，仍需進一步研究。

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The expression of 4－hydroxynonenal in lungs of paraquat－intoxicated rats＊

Xie Shu1，Zhou Congyang2△，Li Fan1，Tang Xuhui1
（1.Department of Emergency，Provincial Peope′s Hospital of Jiangxi，Nanchang，Jiangxi 330006，China；2.Department of Emergency，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

ObjectiveTo investigate the 4－hydroxynonenal（4－HNE）expression changes in lungs of paraquat（PQ）－intoxicated rates.MethodsForty－eight healthy Sprague－Dawley rats were randomly divided into two groups：group A and group B，with 24 rats in each group.The model of lung injury was established by intragastric PQ（80mg／kg）administration in group B，and same quantity of normal saline was administered intragastrically in group A.Pathological changes in lung tissue were observed in 12，24，48and 72hours after treatment.The pathological changes and the expression of 4－HNE in lung tissue were detected.ResultsThere was no significant change in A group.The pathological changes，including alveolar capillary expansion，diffuse alveolar hemorrhage and alveolar inflammation cell infiltration，were found in lungs of rats in group B.Compared with group A，the expression of 4－HNE in lung tissue significantly increased in group B（P＜0.01）.ConclusionThe expression of 4－HNE increased in PQ intoxicated rats.4－HNE may play an important role in rats′lung injury induced by PQ.

paraquat；4－hydroxynonenal；SD rats

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.32.016

A

1671－8348（2012）32－3394－02

江西省衛生廳科技項課題（20111015）。△

：Tel：13979136969；E－mail：zhoucongyang＠sina.com。。

2012－03－29

2012－07－21）

·基礎研究·