骨碎補(bǔ)外用對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠斑禿模型的影響*

黃云英，張德芹，沈 麗，王雪妮，杜 娟，王元元

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

骨碎補(bǔ)外用對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠斑禿模型的影響*

黃云英，張德芹，沈 麗，王雪妮，杜 娟，王元元

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

[目的]考察骨碎補(bǔ)外用對(duì)環(huán)磷酰胺致C57BL/6小鼠斑禿模型的影響。[方法]采用環(huán)磷酰胺腹腔注射建立C57BL/6小鼠斑禿模型，觀察骨碎補(bǔ)外用對(duì)小鼠毛囊組織學(xué)變化和血清細(xì)胞間黏附蛋白（ICAM-1）、內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞黏附分子-1（ELAM-1）水平的影響。[結(jié)果]骨碎補(bǔ)外用能使實(shí)驗(yàn)性斑禿模型小鼠血清ICAM-1和ELAM-1水平降低，毛囊數(shù)增多（P<0.05或P<0.01）。[結(jié)論]骨碎補(bǔ)外用能夠抑制毛囊進(jìn)入退行期，對(duì)斑禿模型小鼠具有治療作用。

骨碎補(bǔ)；外用；環(huán)磷酰胺；斑禿

骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze)J.Sm.的干燥根莖。其味苦，性溫。歸肝、腎經(jīng)。《本草綱目》中記載骨碎補(bǔ)治病后發(fā)落：“胡孫姜（骨碎補(bǔ)）、野薔薇嫩枝煎汁，刷之。”[1]但其所治“病后發(fā)落”與“斑禿”是否有相關(guān)性有待深入考證。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）記載骨碎補(bǔ)“外治斑禿”[2]，但相關(guān)藥理作用研究卻仍處于起步階段，其作用靶點(diǎn)及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脫發(fā)模型觀察骨碎補(bǔ)外用對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期和血清中細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞黏附分子-1（ELAM-1）水平的影響，考察骨碎補(bǔ)外用對(duì)斑禿模型動(dòng)物的治療作用，為《中國(guó)藥典》完善骨碎補(bǔ)“外治斑禿”功能提供藥效學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 骨碎補(bǔ)藥材購于安徽亳州藥材市場(chǎng)，由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李天祥老師鑒定，批號(hào)為2011032。注射用環(huán)磷酰胺，0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為11061821，實(shí)驗(yàn)前用注射用生理鹽水配成所需濃度。2%米諾地爾擦劑為天津市長(zhǎng)征醫(yī)院產(chǎn)品，批號(hào)為20110809。ICAM-1試劑盒、ELAM-1試劑盒均為上海藍(lán)基生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)均為20111114。

1.2 儀器 TD10001電子天平（天津市天馬儀器廠），Infinite M200微量多功能讀板機(jī)（瑞士TECAN公司），BMJ-1生物組織包埋機(jī)（天津航空機(jī)電公司），RM2135切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司），BX41研究級(jí)正置顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

1.3 動(dòng)物 C57BL/6小鼠，8周齡，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由北京市華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2009-0004。

1.4 方法

1.4.1 骨碎補(bǔ)提取 骨碎補(bǔ)藥材550g，粉碎，用60%乙醇回流提取3次，每次1h，回收乙醇至240g。實(shí)驗(yàn)前用60%乙醇配成0.69g/g藥液。

1.4.2 模型制備 按文獻(xiàn)方法[3]，C57BL/6小鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、米諾地爾對(duì)照組、骨碎補(bǔ)高（2.4g/kg）、中（1.2g/kg）、低（0.6g/kg）劑量組。將小鼠用乙醚輕度麻醉后，用石蠟將其背部毛拔掉，誘導(dǎo)生長(zhǎng)期毛囊改變，面積約為3cm×4cm。于拔毛后第9天，除正常對(duì)照組給等量生理鹽水外，其他各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg。

1.4.3 給藥治療 從拔毛第2天開始，模型對(duì)照組小鼠外涂等體積60%乙醇，米諾地爾對(duì)照組外涂2%米諾地爾擦劑0.3mL/只，骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組外涂骨碎補(bǔ)醇提液2.4、1.2、0.6g生藥/kg，每日給藥1次，連續(xù)給藥18d，定時(shí)拍照觀察小鼠毛發(fā)脫落及生長(zhǎng)情況。

1.4.4 指標(biāo)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠摘除眼球取血，注入試管中靜置2h，離心（1000 r/min，20min），分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清中ICAM-1和ELAM-1水平，操作參照試劑盒說明書。再取小鼠背部皮膚，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木-伊紅素（HE）染色，觀察5個(gè)不重疊的視野，計(jì)算每視野平均毛囊個(gè)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 背部拔毛區(qū)皮膚顏色變化 C57BL/6小鼠拔毛后第1～4天內(nèi)，皮膚顏色呈粉紅色，未發(fā)生明顯變化，處于生長(zhǎng)期早期；第5～6天，皮膚顏色逐漸變?yōu)榛疑M(jìn)入生長(zhǎng)期第V亞期；第10～11天，各組小鼠背部拔毛區(qū)皮膚呈黑色并可見新長(zhǎng)出的毛發(fā)；注射環(huán)磷酰胺后4～5d，除正常組外各組小鼠頭部和背部毛發(fā)開始出現(xiàn)脫落；拔毛后第17～18天，正常對(duì)照組新長(zhǎng)出的毛發(fā)已經(jīng)覆蓋整個(gè)脫毛區(qū)，其余各組小鼠皮膚顏色開始變淺變灰，為退行性改變。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。

2.2 組織學(xué)檢查 拔毛后第18天，組織學(xué)檢查各組小鼠毛囊形態(tài)有一定的差異。鏡檢可見正常鼠處于生長(zhǎng)期，皮膚表皮較薄；模型對(duì)照組毛囊數(shù)目明顯減少，毛囊縮短，扭曲，毛囊下段退化，呈營(yíng)養(yǎng)障礙性，毛囊色素生成障礙，毛囊管膨大，呈退行性改變，此外，可見皮膚表皮明顯增生，棘層和顆粒層增厚，細(xì)胞層數(shù)增多；米諾地爾對(duì)照組及骨碎補(bǔ)2.4g/kg劑量組小鼠毛囊數(shù)目接近正常鼠，毛囊較大、較長(zhǎng)，多數(shù)仍為生長(zhǎng)期。米諾地爾對(duì)照組和骨碎補(bǔ)2.4g/kg劑量組毛囊數(shù)與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.3 血清ICAM-1和ELAM-1的檢測(cè)結(jié)果 見表2。模型對(duì)照組ICAM-1和ELAM-1水平提高，明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），給藥后血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低，米諾地爾對(duì)照組和骨碎補(bǔ)0.6g/kg劑量組ICAM-1水平與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），骨碎補(bǔ)2.4、1.2、0.6g/kg劑量組ELAM-1水平與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

表1 骨碎補(bǔ)對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠毛囊的影響（±s）Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide（±s）

表1 骨碎補(bǔ)對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠毛囊的影響（±s）Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide（±s）

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別 劑量（g/kg） 每視野毛囊數(shù)（個(gè)）正常對(duì)照組 54.2±21.0**模型對(duì)照組 26.2±7.9米諾地爾對(duì)照組 0.3mL/只 44.8±15.3*骨碎補(bǔ)高劑量組 2.4 40.5±18.4*骨碎補(bǔ)中劑量組 1.2 31.4±16.5骨碎補(bǔ)低劑量組 0.6 28.7±12.8

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice（±s，n=10）ng/m L

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice（±s，n=10）ng/m L

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別 劑量（g/kg） ICAM-1 ELAM-1正常對(duì)照組 1.03±0.22* 1.07±0.21**模型對(duì)照組 1.37±0.40 1.53±0.50米諾地爾對(duì)照組 0.3mL/只 1.01±0.36* 1.36±0.39骨碎補(bǔ)高劑量組 2.4 1.32±0.23 1.04±0.18**骨碎補(bǔ)中劑量組 1.2 1.17±0.21 1.10±0.20*骨碎補(bǔ)低劑量組 0.6 0.77±0.21** 1.13±0.45*

3 討論

斑禿是在不可預(yù)見的情況下，在不固定區(qū)域發(fā)生的非創(chuàng)傷性毛發(fā)脫落，屬于中醫(yī)“油風(fēng)”、“鬼剃頭”的范疇，但病因至今未明。中醫(yī)認(rèn)為，氣血不足和失于調(diào)達(dá)是脫發(fā)的主要機(jī)制[5]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為先天性脫發(fā)屬常染色體隱性遺傳或其他缺陷，后天性脫發(fā)由某些全身性疾病頭部局部疾患及精神因素、遺傳、內(nèi)分泌障礙性疾病、機(jī)械性或化學(xué)刺激等多種因素造成[6]。其臨床表現(xiàn)往往是多種復(fù)雜因素相互作用的結(jié)果。斑禿的治療是個(gè)世界性的難題，治療斑禿的藥物研究也比較廣泛，從目前看主要為一些調(diào)節(jié)毛囊炎癥和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的藥物。

毛發(fā)生長(zhǎng)經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和休止期的周期性生長(zhǎng)，通過皮膚的顏色可以簡(jiǎn)單地判斷毛發(fā)周期的變化[7]。C57BL/6小鼠軀干皮膚的黑素細(xì)胞只存在于毛囊中，而且僅于生長(zhǎng)期時(shí)合成黑素并傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞，使皮膚變?yōu)楹谏恢镣诵衅冢谒厣蓽p少，皮膚呈灰色；至休止期，黑素合成完全停止，皮膚變?yōu)榉奂t色。此過程受生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)肽、藥物等多種體內(nèi)外因素調(diào)節(jié)。

抗腫瘤藥物引起的毛發(fā)脫落是最常見的生長(zhǎng)期禿發(fā)，這些藥物在消滅迅速分裂的癌細(xì)胞的同時(shí)，也攻擊毛囊四周迅速分裂的細(xì)胞，導(dǎo)致脫發(fā)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，環(huán)磷酰胺能夠?qū)е旅壹?xì)胞凋亡，并明顯提高小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1和ELAM-1的水平，其可能通過調(diào)節(jié)小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1和ELAM-1表達(dá)水平而產(chǎn)生化療性脫發(fā)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，如果臨時(shí)可逆性地抑制ICAM-1和ELAM-1表達(dá)，可以減輕抗癌治療中的毒性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采用8周齡的C57BL/6小鼠背部皮膚拔毛，誘導(dǎo)生長(zhǎng)期毛囊的產(chǎn)生，然后于拔毛后第9天單劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，成功誘導(dǎo)嚴(yán)重的毛發(fā)脫落，建立生長(zhǎng)期禿發(fā)的動(dòng)物模型，研究骨碎補(bǔ)外用對(duì)C57BL/6小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響。通過組織學(xué)觀察到用藥組小鼠毛囊數(shù)較模型對(duì)照組增多，骨碎補(bǔ)外用能夠改善毛囊營(yíng)養(yǎng)，減少退行期毛囊內(nèi)細(xì)胞凋亡，抑制毛囊進(jìn)入退行期，可見骨碎補(bǔ)外用在一定程度上能夠?qū)弓h(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的毛發(fā)脫落。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過骨碎補(bǔ)治療后斑禿模型小鼠血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低，但其促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用是否與其能夠降低血清中ICAM-1和ELAM-1水平有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

[1]明·李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：中醫(yī)古籍出版社,1994：593.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：239．

[3]Paus R,Handjiski B,Eichmüller S,et al.Chemotherapy-induced alopecia in mice.Induction by cyclophosphamide,inhibition by cyclosporine A,and modulation by dexamethasone[J].Am J Pathol, 1994,144(4):719-734.

[4]Slominski A,Paus R.Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesisinhairgrowth[J].JInvestDermatol,1993,101(1Suppl): 90S-97S.

[5]閆秋虹，陳 宏．從氣血論脫發(fā)[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（4）：175－176．

[6]王惠華.中醫(yī)藥治療脫發(fā)[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，14（2）：22．

[7]Paus R,Handjiski B,Czarnetzki BM,et al.A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression(catagen):effects of dexamethasoneandcyclosporinA[J].JInvest Dermatol,1994,103(2): 143-147.

[8]Jimenez JJ,Roberts SM,Mejia J,et al.Prevention of chemotherapyinduced alopecia in rodent models[J].Cell Stress and Chaperones, 2008,13(1):31-38.

[9]刑 飛，姜 波，涂亞庭．環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1及ELAM-1水平的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2010，24（4）：314－317．

Experimental effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in mice

HUANG Yun-ying,ZHANG De-qin,SHEN Li,WANG Xue-ni,DU Juan,WANG Yuan-yuan
（Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae,Institute of traditional Chinese medicine, Tianjin University of TCM,Tianjin 300193，China）

[Objective]To investigate the effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in C57BL/6 mice.[Methods]Severe alopecia was induced by cyclophosphamide in these mice.The hair growth and histological changes were observed in the back skin of them.The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in the serum were determined by ELISA.[Results]The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in herbal group were lower than that in the control group.The nutrition of hair follicles was also improved.[Conclusions]The extract from Drynaria fortunei has a promoting effect on the hair growth by its external application.

Drynaria fortunei;external application;cyclophosphamide;alopecia areata

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0375-03

2012-02-10）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2008BA153B09）。

黃云英（1985-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴幓纠碚摷芭R床應(yīng)用。

張德芹。