正、反相色譜結合分離制備西洋參中的人參皂苷類物質

周 鋒 偉, 姜 照 祥, 付 紹 平, 朱 靖 博

( 大連工業大學 植物資源化學與應用研究所, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

西洋參(PanaxquinquefoliumL.)又稱花旗參、洋參、西洋人參,味苦、性涼、入心、肺、腎經[1],為五加科(Araliaceae)人參屬多年生草本植物,原產于美國東部和加拿大,目前我國已有大面積栽培。西洋參具有補氣養陰,清火生津的功效。其性偏于寒涼,對氣虛而陰津耗傷有熱者最為適宜[2-3]。

人參皂苷是西洋參中的主要活性物質[4-5]。迄今為止,中外學者已從西洋參中分離鑒定出的皂苷類成分的苷元有3種:達瑪烷型(Dammarane)、齊墩果烷型(Oleanane)、奧克梯隆醇型(Ocotillol);而分離出的人參皂苷單體化合物近50種。對于西洋參中高純度單體皂苷制備已有報道[6-7],其中以色譜法分離效果最佳,分離填料的選擇多集中在大孔樹脂、葡聚糖凝膠、硅膠等[8-9]。本文首次采用正相硅膠色譜柱和反相SG-64色譜柱相結合的方法,僅通過兩次柱色譜分離就從西洋參總皂苷中分離得到6個純度超過95%的單體人參皂苷類物質。此方法成本低、效率高、操作簡便。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

西洋參總皂苷粉,沈陽藥科大學提供；薄層層析硅膠,青島海洋化工有限公司；薄層色譜硅膠預制板GF254,煙臺化學工業研究所；反相填料SG-64,購自美國羅門哈斯公司；旋轉蒸發儀,上海申生科技有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀,美國DIONEX公司；Finnigan MAT LCQTMESI接口的離子阱質譜儀,美國Finnigan公司。

1.2 方 法

1.2.1 西洋參總皂苷的初分離

稱取西洋參總皂苷粉130 g,用適量的甲醇溶解,加入200～300目硅膠390 g,水浴蒸干,過程中不斷攪拌,用研缽將其研成粉末,待用。取薄層層析硅膠2.6 kg作為分離膠,用漏斗慢慢裝入到玻璃柱內,使其鋪放均勻(其間要用真空泵把硅膠抽實),在其上用漏斗裝入樣品膠,最上層放置濾紙,然后用洗脫液洗脫。首先用純氯仿平衡柱子,然后按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5,9∶1,…,0.5∶9.5進行梯度洗脫(洗脫液中加千分之一的水),TLC和HPLC檢測分離結果。將具有相同物質的組分合并。

1.2.2 初分物的二次分離

將“1.2.1”得到的粗品組分溶解于10%甲醇水中,上反相SG-64色譜柱,甲醇-水梯度洗脫(10%～100%),HPLC跟蹤檢測,合并單體皂苷物質,減壓濃縮至干。

1.2.3 薄層層析法

用氯仿-甲醇-水[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶35∶10]作展開劑,用碘蒸汽進行顯色。每組餾分進行薄層檢測,根據Rf值,合并具有相同物質的餾分。

1.2.4 液相色譜分析

色譜柱,Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)；體積流量,1.00 mL/min；檢測波長,203 nm；柱溫,室溫；進樣量,20 μL。采用二元梯度洗脫,流動相為乙腈和水。洗脫比例:乙腈體積分數10%(0 min)→20%(5 min)→35%(20 min)→35%(30 min)→43%(45 min)→43%(52 min)→58%(67 min)→75%(72 min)→75%(75 min)。

1.2.5 質譜檢測條件

m/z掃描范圍,100～1 500 U；干燥氣溫度,325 ℃ ；干燥氣體積流量,10.0 L/min；霧化氣壓力,27.6 Pa；離子化方式,ESI(+)和ESI(-)；電噴霧電壓,3 500 V。

2 結果與討論

2.1 化合物的分離

采用正相硅膠真空柱分離,共收集150瓶(2 L/瓶)。根據TLC檢測,合并Rf值相同點的餾分溶液,得到了11組餾分。最后用旋轉蒸發儀濃縮,蒸干得到固體產物。

稱取9.5 g的初分得到的餾分5的干物質,將其溶解于10%的甲醇水中,上于反相SG-64柱(6 cm×60 cm),體積流量70 mL/min,流動相依次以10%～100%甲醇水進行梯度洗脫,HPLC檢測分離結果。合并具有相同物質的餾分,得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ見圖1。

稱取12.5 g的初分得到的餾分7的干物質,將其溶解于10%的甲醇水中,上于反相SG-64柱(6 cm×60 cm),體積流量70 mL/min,流動相依次以10%～100%甲醇水進行梯度洗脫,HPLC檢測分離結果。合并具有相同物質的餾分,得到化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ見圖1。

2.2 化合物的結構鑒定

化合物Ⅰ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖2可知,(-)ESI-MSm/z:846.6[M+HCOO]-,800.4[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:802.5[M+H]+,640.8[M-Glc+H]+,622.3[M-Glc-H2O+H]+,459.7[M-2Glc-H2O+H]+,441.9[M-2Glc-2H2O+H]+,423.8[M-2Glc-3H2O+H]+。通過圖2、3可以發現化合物Ⅰ與化合物Ⅱ的分子質量一樣,與文獻[5]報道中的人參皂苷Rg1和La一致,通過對比化合物在液相色譜上的保留時間可以發現,化合物Ⅱ的保留時間大于化合物Ⅰ,故鑒定化合物Ⅰ為人參皂苷Rg1。

化合物Ⅱ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖3可知,(-)ESI-MSm/z:846.3[M+HCOO]-,800.4[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:802.5[M+H]+,622.3[M-Glc-H2O+H]+。通過與文獻[5]對比,鑒定該物質為化合物Ⅰ的同分異構體人參皂苷La。

化合物Ⅲ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖4可知,(-)ESI-MSm/z:830.4[M+HCOO]-,784.3[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:768.4[M-H2O+H]+,750.4[M-2H2O+H]+,622.0[M-Rha-H2O+H]+,441.9[M-Rha-Glc-2H2O+H]+,423.8[M-Rha-Glc-2H2O+H]+,405.8[M-Rha-Glc-2H2O+H]+。通過參考文獻[5]鑒定該化合物為人參皂苷Rg2。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅵ的高效液相色譜分析結果

圖2 化合物Ⅰ的質譜圖

圖3 化合物Ⅱ的質譜圖

圖4 化合物Ⅲ的質譜圖

化合物Ⅳ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖5可知,(-)ESI-MSm/z:992.8[M+HCOO]-,946.7[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:769.1[M-Glc-H2O+H]+,588.1[M-2Glc-2H2O+H]+。通過參考文獻[6]鑒定該物質人參皂苷Re。

化合物Ⅴ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖6可知,(-)ESI-MSm/z:846.2[M+HCOO]-,800.6[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:783.8[M-H2O+H]+,638.2[M-Rha-H2O+H]+,碎片439、421是人參皂苷P-F11在正離子模式下的特征碎片。鑒定該物質為擬人參皂苷P-F11。

圖5 化合物Ⅳ的質譜圖

圖6 化合物Ⅴ的質譜圖

化合物Ⅵ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應陽性,Molish反應陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖7可知,(-)ESI-MSm/z:992.9[M+HCOO]-,946.7[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:768.2[M-Glc- H2O+H]+,750.3[M-Glc-2H2O+H]+,以上數據與文獻[7]報道一致,因此,可鑒定該化合物為人參皂苷Rd。

圖7 化合物Ⅵ的質譜圖

3 結 論

本文采用硅膠柱層析與反相SG-64柱層析相結合的方式,對西洋參中的人參皂苷類物質進行分離。通過兩次柱層析得到了6個單體化合物,通過HPLC檢測其純度都達到95%。根據單體化合物的理化性質和波譜數據對其進行結構鑒定,確定這6種物質分別是人參皂苷Rg1、人參皂苷La、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、擬人參皂苷P-F11、人參皂苷Rd。與傳統的分離方式對比,該方法分離成本低,效率高。為人參皂苷類物質的大規模生產、藥理學試驗和臨床實驗奠定了基礎。

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