抑制JAK/STAT信號通路對缺血再灌注大鼠心肌的影響

劉冬云 侯云生 王天軼 (白求恩國際和平醫院急診科，河北 石家莊 050082)

隨著急診溶栓、經皮冠狀動脈成形術等再灌注治療的開展，心肌再灌注損傷已成為阻礙缺血心肌從再灌注治療中獲得最佳療效的主要難題。研究表明，Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活系統(JAK/STAT)信號通路與缺血預處理誘導的心肌保護及缺血再灌注損傷(I/R)引起的心功能障礙密切相關〔1〕。但目前有關JAK-STAT信號通路在心肌I/R中的作用還有爭議。本課題擬研究抑制JAK/STAT信號通路對I/R大鼠心肌的影響，有助于從細胞信號轉導水平研究I/R損傷的發病機制，從而為臨床治療I/R損傷提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級Wistar雄性大鼠24只，體重250～300 kg，河北醫科大學實驗動物中心購置，于清潔環境下自由飼養。將實驗動物隨機分為4組，假手術組(C組)，開胸后以5-0無損傷縫線直接穿過冠狀動脈，不結扎;I/R組，建立I/R模型;JAK抑制劑——AG490(I/R+AG490)組，于 I/R前30 min腹腔注射AG 490(8 μg/g);STAT抑制劑——雷帕霉素(RMP)(I/R+RMP)組，I/R 前30 min腹腔注射 RMP(0.4 μg/g)。

1.1.2 主要試劑 兔抗JAK2多克隆抗體、兔抗STAT1多克隆抗體、兔抗STAT3多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產品，兔抗p-JAK2多克隆抗體、兔抗p-STAT1多克隆抗體、兔抗p-STAT3多克隆抗體均為美國Cell Signaling公司產品，TUNEL細胞凋亡試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌I/R模型的建立 Wistar大鼠以90 mg/kg選用3%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉注射。固定大鼠，常規取材前準備，并記錄全導心電圖，以潮氣量5 ml/100 g的小動物呼吸機輔助呼吸，造模過程中根據呼吸頻率、強度調整其參數，于胸骨左側約0.5 cm處、第3～5肋間切口，鈍性分離至肋間隙，剪斷第三、四肋，使得在胸腔暴露的情況下刺穿心包膜，用5-0無損傷縫線在左冠狀動脈前降支處穿過心肌表層，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，穩定10 min后將一膠管(1.5～2.0 mm)平行置于冠狀動脈表面，連同硅膠管一起結扎冠狀動脈前降支，使膠管壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，結扎。

模型成功標準:全導心電圖示在心肌I/R過程中伴有ST段變化或QRS波增寬、增高，結扎線以下心肌顏色變暗，表示結扎成功。結扎30 min后，剪斷結扎線，拔除硅膠管，再灌注120 min。再灌注成功即心肌顏色變為鮮紅。假手術組僅穿線不結扎，AG490組及RMP組于I/R前30 min分別注射AG490 8 mg/kg、RMP 0.4 mg/kg。

1.2.2 Western印跡檢測 采用常規方法進行操作。再灌注結束后取出心臟，洗凈血跡，剪去右室及心房，用濾紙吸干，取左心室前壁液氮冷凍。從液氮罐中取出心肌組織置于勻漿器中，加入細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02%NaN3，0.1%SDS，100 μg/ml PMSF，1 μg/ml抑酞酶，1%NP-40，0.5%去膽酸鈉)，置于冰上進行勻漿，裂解30 min后即用移液器移置1.5 ml離心管中，12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于－80℃保存。Lowry法測定總蛋白量，調蛋白質濃度為200 μg。總的蛋白提取物經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，將蛋白轉移至醋酸纖維膜上，分別與抗JAK2、STAT1、STAT3多克隆抗體，抗pTyr-JAK2、抗pTyr-STAT1、抗pTyr-STST3共同孵育2 h，然后洗脫，封閉后加入1∶2 000的二抗(辣根酶記的羊抗兔IgG抗體)，室溫下雜交1 h，化學發光試劑增強反應，X光壓片曝光，漂洗后自顯影。用密度掃描儀測定條帶的密度(OD)，以光密度代表細胞外信號調節激酶(EPK)蛋白的相對表達值。

1.2.3 組織切片制備 取出心臟，洗凈血跡，剪取右心室和心房，用濾紙吸干，置于4%多聚甲醛中固定24 h，從心尖始以間距0.3 cm橫向連續切片至冠狀動脈穿線處，石蠟包埋切片。

1.2.4 細胞凋亡檢測(原位末端標記法，TUNEL) ①冰凍切片用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 min，2次，蒸餾水洗2 min，2次;②3%的H2O2阻斷內源性辣根過氧化物酶室溫處理10 min，蒸餾水洗;③每片加標記緩沖液20 μl，以保持切片的濕潤，按每張切片取 TdT 和DIG-d-UTP各1 μl，加入18 μl標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液。置樣品于濕盒中，37℃標記2 h;④0.01 mol/L Tris鹽酸緩沖液(TBS)，每片加封閉液50 μl，室溫30 min甩掉封閉液，不洗;⑤1∶100稀釋地高辛抗體，混勻后50 μl/片加至標片上，置樣品于濕盒中，37℃反應30 s，0.01 mmol/L TBS沖洗;⑥用抗體稀釋液1∶100稀釋，生物素-鏈霉親合素-過氧化物酶法(SABC):取1 ml抗體稀釋液加 SABC 10 μl，混勻后 50 μl/片加至切片，37℃ 反應30 s，0.01 mmol/L TBS洗;⑦二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度復染，脫水、封片。每張切片拍攝5個視野，根據每個視野中心肌細胞陽性數量計算百分比，作為凋亡指數(AI)。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，以±s表示;計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 Western印跡檢測結果 假手術組 p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3少量表達;與假手術組比較，缺血再灌注后p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3表達明顯增加，且p-STAT1較p-STAT3的表達增加明顯;應用 AG490后，p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3的表達減少;應用RMP后p-JAK2、p-STAT1的表達無改變，p-STAT3的表達減少。見圖1。

2.2 心肌細胞凋亡檢測的結果 假手術組、I/R組、AG490組、RMP組 AI分別為4.25±2.04，12.58±1.35，7.36±1.30，13.32±1.58，組間比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 Western印跡檢測結果

3 討論

業已證實，胞內信號轉導途徑JAK/STAT信號通路主要將胞膜感受的信號直接傳遞到核內，從而啟動基因轉錄，其中JAK是胞質內非受體型的一類可溶性酪氨酸蛋白激酶，已知有4 個亞型——JAK1、JAK2、JAK3 及 TYK2;而 STATS屬于人和哺乳動物共有的可與靶基因調控區DNA結合的另外一類胞質蛋白家 族，有 7 個 亞 型——STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，上述兩種均可在心肌細胞表達。

有研究顯示，G蛋白耦聯的神經激素(AngⅡ、腺苷、內皮素等)、細胞因子(白介素、腫瘤壞死因子等)等胞外信號轉導可通過激活蛋白激酶JAK，進而影響STATS磷酸化，產生心肌I/R，從而進入細胞核發揮生物效應。據此推測，JAK-STAT信號通路可能參與了I/R過程。本研究成功建立了在體大鼠心肌I/R模型，發現缺血30 min再灌注120 min后，大鼠心肌磷酸化的JAK2、STAT1、STAT3數量都增高，同時磷酸化的STAT1數量遠較磷酸化的STAT3多，凋亡的心肌細胞也明顯增多。于I/R前30 min給大鼠腹腔注射JAK2抑制劑AG490后 JAKs和STATs的活化被顯著抑制，凋亡的心肌細胞數量也明顯減少。于I/R前30 min給大鼠腹腔注射RMP對磷酸化的JAK2及STAT1數量沒有影響，但能抑制STAT3的磷酸化，使p-STAT1和p-STAT3的比例增高，同時凋亡的心肌細胞數量與I/R組相比增多。綜上所述，心肌I/R后JAK/STAT信號通路被激活，且STAT1和STAT3的激活對心肌具有相反的作用〔2，3〕，心肌缺血時伴有的細胞凋亡時STAT1表達增加、轉錄活性增強，而激活的STAT3不僅抑制心肌細胞凋亡，還能發揮心肌保護作用〔4〕。大鼠心肌I/R時，JAK/STAT通路的激活可能加重心肌損傷，而心肌損傷的程度可能與p-STAT1和p-STAT3的比例有關，p-STAT1和p-STAT3的比例越高，心肌損傷的程度可能越重。而AG490作為JAK2的特異性拮抗劑，可減少心肌梗死面積，降低細胞凋亡并促進心功能的恢復〔5，6〕，從而能減輕I/R導致的心肌損傷。

1 Booz GW，Day JN，Baker KM.Interplay between the cardiac renin angiotensin system and JAK/STAT signaling:role in cardiac hypertrophy，ischemia/reperfusion dysfunction，and heart failure〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2002;34(11):1443-53.

2 Boengler K，Buechert A，Heinen Y，et al.Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in aged and STAT3-deficient mice〔J〕.Circ Res，2008;102(1):131-5.

3 高美華，張 麗，李 冰，等.川穹嗪對AngⅡ誘導大鼠心肌肥大細胞JAK-STAT通路作用〔J〕.細胞與分子免疫學，2011;27(5):519-22.

4 Barry SP，Townsend PA.Role of the JAK-STAT pathway in myocardial injury〔J〕.Trends Mol Med，2007;13(2):82-9.

5 Ng DCH，Court NW，dos Remedios CG，et al.Activation of signal transducer and activator of transcription(STAT)pathways in failing human hearts〔J〕.Cardiovasc Res，2003;57(2):333-46.

6 劉雪平，董泗芹，鄭 敏，等.貝那普利阻斷RAS對自發性高血壓大鼠心肌JAK-STAT信號通路的影響〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(17):1651-4.