果糖制備的糖基化終末產物對大鼠離體血管環舒張功能的損傷作用及氯沙坦的保護機制

鄭凌云 趙宇紅 (廣東藥學院基礎學院生理學系，廣東 廣州 510006)

動物研究證實，高果糖飲食引起的血管內皮功能紊亂在促進高血壓形成中有重要作用〔1〕，但其具體的分子基礎并不清楚。研究表明，果糖代謝產生的甲基乙二醛等中間產物可促進血管平滑肌細胞產生活性氧(ROS)，并降低內皮細胞NO的釋放，從而可能引起血管內皮功能紊亂〔2〕;而且果糖比葡萄糖更容易引起體內生物大分子的非酶糖基化作用〔3〕，從而產生糖基化終末產物(AGEs)。因此，高果糖引起的血管內皮功能紊亂可能是通過AGEs的形成而介導的。而目前有關AGEs的研究基本上都是利用葡萄糖制備所得，研究顯示，AGEs可引起血管內皮細胞凋亡〔4〕。近年來的研究還提示，AGEs引起的血管舒張功能紊亂與血管緊張素受體(AT1)活化密切相關〔5〕。但對于果糖制備的AGEs對血管舒張的影響，以及AT1在其中的作用尚未見報道。因此，本研究采用離體大鼠胸主動脈環，研究高果糖制備的AGEs對血管環舒張功能的影響，以及AT1在其中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 D-果糖(純度≥99%，上海生物工程公司)，牛血清白蛋白(BSA，純度≥98%，Sigma公司)，β-肌動蛋白(β-actin)抗體(boster bio-engineering公司)，p-eNOS(兔抗大鼠，Cell signaling technology)，磷酸化蛋白酶 B(p-AKT，兔抗大鼠，SAB)，powerlab生物信號采集處理系統(AD instrument，澳大利亞);雄性SD大鼠200～220 g(中山大學實驗動物中心提供，合格證號:0098406)，組織裂解液(millipore公司)，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED，Sigma 公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(millipore公司)，抗兔二抗(boster bio-engineering公司)，蛋白酶抑制劑 cocktail(Sigma公司)，電化學發光法(ECL)化學發光劑(cell signaling technology公司)，酶聯免疫分析儀(美國MJ research公司)，垂直電泳裝置(美國Bio-Rad公司)，凝膠掃描分析系統(美國 Advanced American biotechnology公司)，高速冷凍離心機(德國Beckman公司)，熒光分光光度儀(HITACHI U3010，Japan)，紫外分光光度儀(島津 UV-265FM，日本)。

1.2 方法

1.2.1 利用果糖制備AGEs并檢測AGEs的形成情況 按文獻方法〔6〕，采用果糖作為還原糖制備糖基化的BSA。具體方法如下:取BSA(10 mg/ml)與D-果糖(250 mmol/L)在磷酸鉀緩沖液(PBS，200 mmol/L，pH7.4)中用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解，體積分數＜0.2(V/V)，則不影響反應進行。以上試劑均用0.2 μm濾膜進行無菌過濾，并于37℃、5%CO2混合氣體環境中孵育6 d。反應混合物用PBS透析48 h，以除去多余未結合果糖，用熒光分光光度儀測定產物的熒光密度，其激發波長為370 nm，發射波長440 nm。AGEs對照組采用D-果糖與PBS在同樣條件下孵育6 d，空白對照組則用BSA與PBS孵育，氨基胍(20 mmol/L)+AGEs作為陽性對照組。

1.2.2 離體動脈環實驗設計與分組 分為空白對照組、BSA對照組和 AGEs組以及氯沙坦 50 μmol/L組、氯沙坦10 μmol/L+AGEs組、氯沙坦 50 μmol/L+AGEs組。各組血管環與AGEs、氯沙坦以及氯沙坦+AGEs的孵育時間為1 h，隨后分別檢測乙酰膽堿(Ach)介導的內皮依賴的血管舒張(EDR)和硝普鈉(SNP)介導的非內皮依賴性舒張反應(NEDR)。

1.2.3 離體動脈環的制備和血管張力測定 取SD大鼠，斷頭處死后，打開胸腔，迅速取出胸主動脈條上段，并置于預冷的Krebs-Henseleit(K-H)液中。K-H液成分(mmol/L):NaCl 120、NaHCO325、KH2PO41.2、MgSO41.2、KCl 4.5、CaCl21.25、glucose 11.1。用顯微器械小心剔除血管周圍的脂肪以及結締組織，并將血管剪成約3～4 mm的主動脈環后，快速懸掛于離體血管環灌流裝置中，將灌流浴槽內充以37℃的K-H液，并持續給予95%O2和5%CO2的混合氣體，讓血管環在無張力情況下維持15 min。逐步調節血管環張力至2 g，并維持1 h，期間每隔15 min換一次液。用100 mmol/L的KCl刺激，反復三次，以激發血管環的最大收縮，如兩次的最大收縮幅度差小于5%認為血管反應性良好。之后給予10－6mol/L的苯腎上腺素引發預收縮，再用10－5mol/L的Ach舒張血管環以檢查內皮的完整性。各組血管環在藥物處理1 h后，分別測定對Ach和SNP介導的舒張反應。血管環舒張反應以血管舒張力占血流峰值速度(PE)(10－6mol/L)預收縮時引起的最大收縮張力的百分比表示，并計算最大舒張百分率(Emax)。

1.2.4 血管環組織中NO含量測定 收集各組血管環，加入冰預冷的PBS液，冰上進行組織勻漿后以4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清100 μl進行蛋白定量，并按照NO檢測試劑盒說明書用紫外分光光度儀進行NO含量測定。

1.2.5 免疫印跡檢測血管環中eNOS、AKT的磷酸化表達 收集各組血管環，加入冰預冷的組織蛋白裂解液，用顯微剪在冰上剪碎組織，并振蕩裂解30 min，離心取上清，用雙辛可寧酸(BCA)法進行蛋白定量，調整各組蛋白上樣量，使每個加樣孔總蛋白量一致。取一定量蛋白上清液，與蛋白質相對分子質量Marker一起進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳。電泳分離蛋白質，卸下分離膠，置于電轉緩沖液中平衡30 min。轉移到PVDF膜上，室溫下封閉，孵育p-eNOS抗體(1∶400)以及p-AKT(1∶500)抗體4℃過夜，PBS室溫洗脫，孵育二抗(抗HRP標記的二抗稀釋倍數為1∶1 000)1 h，PBST室溫洗脫1 h，中間換液3次。取發光試劑盒中的發光底物溶液和增強劑溶液各0.25 ml，加入去離子水稀釋至5 ml，混勻靜置1 min后，與膜作用3 min，在暗室中，使X光膠片感光。膠片用凝膠成像系統掃描分析灰度。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，各組數據以±s表示，組間采用方差分析。

2 結果

2.1 果糖制備的AGEs的鑒定和檢測 取AGEs制備各組，進行熒光分光光度儀測定，根據標準曲線得到所制備的AGEs的FU值為2 989 FU/ml。用D-果糖或BSA單獨與PBS孵育并不能形成AGEs，而上述兩者共同孵育后，可在440 nm處得到一個最大峰，并且用氨基胍作為抑制AGEs形成的陽性對照藥物，結果顯示氨基胍有效抑制了果糖所制備的AGEs，提示AGEs制備成功。BSA組、D-果糖組未形成AGEs，AGEs組及AGEs+AS組AGEs形成率分別為98.5%及11.2%。

2.2 AGEs以及氯沙坦對Ach介導的大鼠胸主動脈環舒張反應的影響 AGEs預處理大鼠胸主動脈環1 h后，可明顯抑制Ach引起的內皮依賴的血管舒張反應，其Emax僅為(32.45±2.93)%(P＜0.01);單獨氯沙坦(50 μmol/L)預處理組和AGEs對照組的BSA均不影響血管環的內皮依賴性舒張，兩組間相比無統計學差異(P＞0.05)，其Emax分別為(82.14±6.14)%和(81.42±2.36)%，提示果糖制備的AGEs可引起血管環舒張功能降低，而與BSA和氯沙坦藥物本身無關。見圖1。

圖1 AGEs及氯沙坦對大鼠胸主動脈環舒張反應的影響

2.3 AGEs以及氯沙坦對血管環組織中NO含量(μmol/mg)的影響 AGEs預處理血管環1 h后，與對照組BSA(113.47±4.73)相比，NO含量(88.41±5.32)明顯降低(P＜0.01)，而氯沙坦10 μmol/L(92.43±2.85)不能有效逆轉AGEs抑制作用(P＞0.05)，50 μmol/L氯沙坦(102.42 ±3.57)可較明顯的恢復血管壁中NO產生(P＜0.05)。而單獨應用氯沙坦50 μmol/L組血管環組織中NO含量為(110.84±5.16)μmol/mg，提示AGEs可能通過抑制NO合成導致血管環內皮依賴舒張功能降低，氯沙坦則可逆轉這一作用，進一步說明AGEs可能活化血管內皮細胞的AT1而影響NO的生成。

2.4 AGEs以及氯沙坦對血管環中eNOS和AKT磷酸化的影響 AGEs預處理血管環1 h后，血管環中eNOS活性明顯下降(P＜0.01)，而對照組BSA和單獨氯沙坦藥物處理1 h后，血管環中eNOS無顯著差別，提示AGEs引起的血管舒張功能降低與其抑制eNOS磷酸化有關。給予氯沙坦(10 μmol/L)和AGEs共同孵育1 h后，血管環中eNOS活性與單純AGEs處理組相比有所升高(P＜0.05);而50 μmol/L氯沙坦可明顯恢復eNOS活性(P＜0.01)，提示AGEs引起的血管舒張損傷機制可能與AT1受體的活化有關。進一步檢測AKT磷酸化水平，結果發現AGEs預處理后AKT磷酸化與BSA對照組相比明顯下調(P＜0.01)，而氯沙坦可恢復AKT磷酸化，提示AGEs引起的eNOS活性降低可能是通過AT1受體抑制PI3K/AKT信號途徑活化，進而引起血管環舒張功能損傷。見圖2。

圖2 AGEs及氯沙坦對血管環eNOS和AKT磷酸化的影響

3 討論

AGEs在糖尿病血管并發癥中有十分重要的作用〔7〕。研究證實，高果糖飲食會導致動物出現胰島素抵抗和血管內皮功能紊亂〔8〕，但其具體的分子基礎并不十分清楚。既往研究〔9〕和本文結果都證實，果糖和BSA在37℃條件下共同孵育6 d即可生成AGEs，因此提示高果糖對血管的舒張功能損傷可能與促進AGEs的形成有關。

本實驗中采用文獻報道的方法，用果糖作為還原糖，對BSA進行修飾以得到AGEs。用AGEs預處理大鼠胸主動脈環1 h后，發現果糖制備的AGEs引起內皮完整的血管環對Ach的舒張反應明顯下降，而對硝普鈉引起的血管環舒張無顯著作用，提示果糖制備的AGEs主要引起內皮依賴的血管舒張反應受損，這與葡萄糖制備的AGEs的損傷作用相似。進一步觀察了血管環組織中eNOS磷酸化的表達，發現與BSA組相比，AGEs可明顯降低eNOS的磷酸化水平，而氯沙坦與AGEs共同孵育血管環后，eNOS磷酸化水平有所增加，而50 μmol/L氯沙坦本身對eNOS的磷酸化水平與BSA的作用無統計學差異，提示果糖制備的AGEs可能通過抑制eNOS活性、降低內皮細胞來源的NO水平引起舒張功能下調，而50 μmol/L的氯沙坦可明顯逆轉這一變化，進一步提示AT1介導了AGEs引起的急性血管舒張功能損傷過程;有研究表明，葡萄糖制備的AGEs引起的血管內皮損傷與PI3K/AKT活性有關〔4〕，因此，本文還觀察了各組血管環中AKT的磷酸化水平，結果顯示果糖制備的AGEs顯著降低AKT的磷酸化，而氯沙坦預處理后可恢復AKT磷酸化水平，提示果糖制備的AGEs引起的eNOS活性下降與PI3K/AKT信號途徑有關，而氯沙坦的保護作用則說明AT1活化參與急性AGEs引起的血管舒張功能損傷。通過檢測血管環中NO含量，本文也證實AGEs的損傷作用與NO合成下調有關。進一步的分子機制還需要在細胞水平進行研究。

綜上所述，高果糖制備的AGEs可以導致血管內皮功能紊亂，但在制備AGEs的時間上明顯短于葡萄糖，提示果糖在誘導AGEs形成中的重要性。而且，果糖制備的AGEs能明顯損害內皮的eNOS活性，從而引起NO生成降低，而AT1阻斷劑氯沙坦的保護作用提示急性的AGEs引起的血管舒張反應降低也與AT1活化有關，并且可能通過抑制PI3K/AKT信號途徑調控eNOS的活化。

1 Kim JA，Montagnani M，Koh KK，et al.Reciprocal relationships between insulin resistance and endothelial dysfunction:molecular and pathophysiological mechanisms〔J〕.Circulation，2006;113(15):1888-904.

2 Dhar A，Dhar I，Desai KM，et al.Methylglyoxal scavengers attenuate endothelial dysfunction induced by methylglyoxal and high concentrations of glucose〔J〕.Br J Pharmacol，2010;161:1843-56.

3 Lee O，Bruce WR，Dong Q，et al.Fructose and carbonyl metabolites as endogenous toxins〔J〕.Chem Biol Interact，2009;178(1-3):332-9.

4 Xiang Y，Li Q，Li M，et al.Ghrelin inhibits AGEs-induced apoptosis in human endothelial cells involving ERK1/2 and PI3K/Akt pathways〔J〕.Cell Biochem Funct，2011;29(2):149-55.

5 Schupp N，Schinzel R，Heidland A，et al.Genotoxicity of advanced glycation end products:an involvement of oxidative stress and of angiotensinⅡtype 1 receptors〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2005;1043:685-95.

6 Kim HY，Kim K.Protein glycation inhibitory and antioxidative activities of some plant extracts in vitro〔J〕.J Agric Food Chem，2003;51(6):1586-91.

7 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature，2001;414(6865):813-20.

8 Tran LT，Yuen VG，Mc Neill JH.The fructose-fed rat:a review on the mechanisms of fructose-induced insulin resistance and hypertension〔J〕.Mol Cell Biochem，2009;332(1-2):145-59.

9 Hao M，Li SY，Sun CK，et al.Amelioration effects of berberine on diabetic microendothelial injury model by the combination of high glucose and advanced glycation end products in vitro〔J〕.Eur J Pharmacol，2011;654:320-5.