不同缺血后處理對缺血再灌注大鼠腦內IL－1β、IL－6表達的影響

孔渝菡 秦新月 (重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科 重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016)

腦缺血后處理(IPC)是在腦缺血后再灌注初期通過各種物理或藥物方式實施的一種干預手段，是近年來發現的能減少缺血性腦損傷的方法，但其最佳實施策略及具體保護機制仍存在爭議〔1〕。本研究擬探討不同方式的缺血后處理對MCAO/再灌注大鼠缺血側IL-1β、IL-6表達的影響及軸突損傷情況，推測缺血后處理的可能機制。對于臨床上缺血性腦血管疾病的防治具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年健康SD大鼠，體重250～280 g，雌雄各半，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。大鼠25只，隨機分為5組，分別為假手術組、缺血/再灌注組(I/R)、近端后處理組(IPC)、遠隔后處理組(RIPC)、延遲后處理組(DIPC)，每組5只。選術后48 h為觀察時間點，實驗過程中動物飼養及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規定。

1.2 局灶性缺血再灌注模型制作 大鼠術前稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)，根據Longa等〔2〕報道的方法制作大鼠大腦中動脈缺血/再灌注(MCAO)模型碘附消毒頸部皮膚，作頸部正中切口，暴露右側的頸總動脈，頸外動脈和頸內動脈，燒斷頸外動脈和頸內動脈的分支，并結扎燒斷頸外動脈，用眼科剪在頸外動脈殘端做一切口，將預先浸好石蠟的漁線從頸外動脈切口緩慢插入頸內動脈，在漁線進入約18～20 mm(從頸外動脈分叉處算起)微感到阻力時，在頸外動脈處結扎切口，完成右側MCA血流阻塞。再灌注方法為MCA血流阻塞2 h后將栓線退到頸總動脈分叉處。

1.3 缺血后處理實施方案 分離大鼠雙側頸總動脈，再灌注后立即夾閉雙側頸總動脈，IPC組:同時阻斷雙側頸總動脈(bCCA)血流5 min，恢復5 min，如此進行3次缺血/再灌注過程;RIPC組:分離并阻斷右下肢股動脈血流5 min，恢復5 min，如此進行3次缺血/再灌注循環;DIPC組:阻斷bCCA血流5 min，恢復5 min，如此進行3次缺血/再灌注循環。

1.4 組織學檢測 固定后的大鼠腦組織經石蠟包埋后切片，于前囟后方2 mm處進行連續冠狀切片(片厚4 μm)，按說明書進行免疫組織化學法染色、DAB顯色并封片。在熒光顯微鏡下觀察陽性細胞，每張免疫組化切片中采集5個具有代表性的高倍視野，通過Image Pro Plus 6.0軟件測量分析光密度值(OD)。

2 結果

2.1 不同方式缺血后處理后大鼠缺血側皮質及海馬的IL-1β、IL-6表達 在皮質區，I/R組48 h后IL-1β、IL-6含量顯著高于假手術組(P＜0.01)。IPC與RIPC組和 I/R組比較，IL-1β、IL-6含量顯著降低(P＜0.05)。DIPC組與I/R組比較差異不明顯。在海馬區缺血/再灌注48 h后大鼠海馬CA1～CA3區可見IL-1β、IL-6陽性細胞表達，除DIPC組外，其余后處理組與I/R組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.2 不同方式缺血后處理后大鼠缺血側皮質及海馬NF-200表達 腦缺血后神經軸突發生壞死、形態紊亂，NF-200表達減少，在皮質區神經軸突，I/R組NF-200光密度值顯著低于假手術組(P＜0.01)。IPC與RIPC組和I/R組比較，NF-200表達明顯增多(P＜0.01)。DIPC組與I/R組比較差異不明顯(P＞0.05)。在海馬缺血/再灌注48 h后大鼠海馬軸突可見明顯的NF-200表達，除DIPC組外，其余后處理組與I/R組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2，圖3。

表1 各組大鼠缺血側皮質及海馬IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

表1 各組大鼠缺血側皮質及海馬IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05，下表同

組別 IL-1β的光密度值皮質 海馬IL-6的光密度值皮質 海馬假手術組 0.13±0.026 0.14±0.021 0.23±0.034 0.24±0.031 I/R 0.42±0.0381) 0.34±0.0421) 0.58±0.0501) 0.50±0.0471)IPC 0.37±0.0301)3)0.29±0.0341)3)0.48±0.0481)2)0.43±0.0461)3)RIPC 0.35±0.0421)2)0.29±0.0461)3)0.49±0.0491)2)0.44±0.0531)3)DIPC 0.40±0.0411) 0.33±0.0301) 0.55±0.0791) 0.47±0.0441)

表2 各組大鼠缺血側皮質及海馬NF-200光密度值表達(± s，n=5)

表2 各組大鼠缺血側皮質及海馬NF-200光密度值表達(± s，n=5)

組別 皮質 海馬假手術組0.54±0.051 0.54±0.069 I/R 0.20±0.0351) 0.17±0.0441)IPC 0.31±0.0841)2) 0.37±0.0471)2)RIPC 0.31±0.0441)2) 0.25±0.0491)3)DIPC 0.21±0.0451) 0.21±0.0321)

圖1 不同缺血后處理后缺血側皮質IL-1β表達(DAB，×200)

圖2 不同缺血后處理后缺血側皮質IL-6表達(DAB，×200)

圖3 缺血48 h后缺血側皮質和海馬的軸突(DAB，×200)

3 討論

炎癥、凋亡及細胞因子的上調在缺血性腦損傷中起著重要作用。IL-1β，IL-6作為炎癥因子的重要組成部分在一定程度上反映了炎癥的嚴重程度。IL-1β受促炎癥因子TNF-α誘發激活，并協同刺激IL-6產生，在缺血性腦損傷中增高，并產生級聯效應加重缺血局部的免疫炎癥反應而加重神經系統的損害〔3，4〕。本研究提示缺血后處理可能減少了腦缺血后出現的急性炎癥反應這一重要病理過程從而起到神經保護作用。NF-200是神經微絲與其他細胞骨架(微管等)的主要聯系體，它是一種與神經元生長、發育過程有關的蛋白，主要存在于神經元軸突。腦缺血后神經軸突發生壞死、形態紊亂，NF-200表達減少，當神經修復時由于神經再生需要，神經元在各種誘導因子作用下使NF合成增多，并通過軸漿運輸到軸突，NF-200表達增加〔5〕。由此NF-200能反映腦損傷后神經損傷和修復的程度。本研究顯示，通過缺血后處理的實施，各組大鼠腦組織中NF-200表達降低，提示幾種后處理方式均能不同程度地減輕腦缺血造成的神經軸突損傷，保護軸突的完整進而促進神經的再生和修復。

缺血后處理的方式可以是近缺血部位也可以是遠隔部位的處理，且均能有效減少缺血部位的損傷，這為它的臨床應用提供了良好的拓展空間。通過本研究，我們認為5 min×3循環的近端和遠隔部位后處理均能有效減少腦缺血再灌注損傷，這和以往報道缺血后處理具有器官保護作用的情況類似〔1〕。而1 d后的延遲后處理沒有起到明顯的腦保護作用，提示1 d后延遲保護時相可能已過〔6〕。綜上我們推論，早期進行近端或遠隔部位的缺血后處理能減少腦缺血再灌注后發生的炎癥反應，保護神經軸突，從而減小再灌注損傷，為神經再生提供有利環境。

1 Zhao H.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2009;29:873-85.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

3 van der Pouw Kraan TC，Kasperkovitz PV，Verbeet N，et al.Genomics in the immune system〔J〕.Clin Immunol，2004;111:175-85.

4 Yang J，Ding JW，Chen LH，et al.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Inflammation，2008;31:304-12.

5 Shaw G，Yang C，Ellis R，et al.Hyperphosphorylated neurofilament NF-H is a serum biomarker of axonal injury〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;336:1268-77.

6 Ren C，Gao X，Niu G，et al.Delayed postconditioning protects against focal ischemic brain injury in rats〔J〕.PLoS One，2008;3:e3851.