不同給藥途徑伊立替康在家兔體內的藥代動力學和生物利用度

繳萬里 劉海潔 張熙杰 張桂榮 王玉紅 曹德英 (唐山市工人醫(yī)院藥學部，河北 唐山 06000)

鹽酸伊立替康 (Irinotecan Hydrochloride)是喜樹堿類上市的新藥之一，是用于轉移性結、直腸癌一線治療的化療藥，對氟尿嘧啶耐藥病例仍有效〔1，2〕。目前市場上伊立替康僅有注射劑一種劑型，主要的不良反應為中性粒細胞減少癥和腹瀉，長期大劑量應用患者難以耐受。因為注射劑使用不方便，患者依從性差。而且伊立替康在臨床使用時都必須佩戴眼鏡、口罩、手套，給醫(yī)務人員的操作帶來很多困難。國外文獻報道，動物口服伊立替康后有一定的生物利用度，提示伊立替康可以血管外給藥。因此，為使患者用藥更加方便、安全，本文試制了伊立替康中空栓，并以市售的注射用鹽酸伊立替康為參比制劑，研究伊立替康中空栓在動物體內的藥代動力學和絕對生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 美國Waters 2690高效液相色譜儀及474熒光檢測器，Millennium32數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Agilent TC-C18色譜柱;ZH-2型自動漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠);TGL-16C型臺式高速離心機(上海弗魯克機電設備有限公司);800型臺式離心機(上海手術器械廠);PHS-3C型臺式精密pH計(上海雷磁儀器廠);分析天平(上海天平儀器廠);Gilson P型移液器(法國)。

1.1.2 試劑 鹽酸伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:616090901);注射用鹽酸伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:10032311);伊立替康中空栓(自制，每枚含伊立替康80 mg);甲醇、乙腈為色譜純;磷酸氫二鈉、辛烷基磺酸鈉、磷酸為分析純;重蒸餾水(自制)。

1.1.3 動物 健康家兔(大耳白家兔，許可證編號:SCXK(京)2009-0014)，體重(2.5±0.3)kg，雌雄兼用，母兔無孕。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6×150 mm;5 μm);進 樣 量 10 ～ 50 μl;流 動 相:0.05 mol/L Na2HPO4(pH3.0，內含 0.05 mol/L 辛烷基磺酸鈉)-乙腈 =68∶32〔3〕;流速1.0 ml/min;檢測波長:Ex 370 nm，Em 430 nm;柱溫:室溫。

1.2.2 樣品處理 取含藥血漿200 μl，加600 μl冷甲醇，渦旋混合30 s，離心，取上清液10～50 μl進樣分析。

1.2.3 給藥方法及血樣采集 取健康家兔10只，隨機分為兩組，每組5只。第1組為靜脈注射組;第2組為伊立替康中空栓直腸給藥組。用藥前，家兔禁食12 h，自由飲水，用藥后6 h開始進食。靜脈組于耳緣靜脈注射鹽酸伊立替康，給藥劑量為60 mg/只〔4〕，分別于給藥后 0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h耳緣靜脈取血1.0 ml，加至預先加入肝素的塑料試管中，立即離心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分離得到血漿樣品。直腸給藥組由直腸給予伊立替康中空栓2枚，封閉肛門，給藥劑量為 160 mg/只〔4〕，分別于給藥后 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、48 h 耳緣靜脈取血 1.0 ml，加至預先加入肝素的塑料試管中，立即離心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分離得到血漿樣品。同上述“1.2.2”方法進行處理。

1.2.4 制備標準溶液 精密稱量鹽酸伊立替康標準品5 mg，用0.01 mol/L HCl溶液定容于25 ml量瓶中，得200 μg/ml的標準儲備液。將其稀釋配制成20 μg/ml的標準溶液備用。取1.9 ml空白血漿，加入100 μl鹽酸伊立替康標準溶液，混勻，配成1 000 ng/ml的伊立替康標準含藥血漿，再用空白血漿逐步稀釋，配制成伊立替康濃度分別為 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml的系列標準含藥血漿。

1.2.5 標準曲線的制備 取伊立替康系列濃度的標準含藥血漿，按“1.2.2”方法處理后，進樣10 ～50 μl，得到對應的峰面積，重復3次，以標準品系列濃度對應的峰面積(A)為縱坐標，其系列濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線A=bC+a。

1.2.6 回收率測定

1.2.6.1 提取回收率 按標準溶液的制備方法，取兔空白血漿，加入一定體積的鹽酸伊立替康標準溶液，配制成濃度為80、400、800 ng/ml的血漿樣品，按“1.2.2”方法處理，進樣 50 μl，作高效液相色譜法(HPLC)分析，記錄峰面積，與同濃度的鹽酸伊立替康標準品溶液直接進樣10～50 μl所測定的峰面積比較，計算提取回收率。

1.2.6.2 方法回收率 按標準溶液的制備方法，取兔空白血漿，加入一定體積的鹽酸伊立替康標準溶液，配制成濃度為80、400、800 ng/ml的血漿樣品，按“1.2.2”方法處理，進樣10～50 μl，記錄峰面積，由標準曲線計算出的濃度為伊立替康的測定濃度，伊立替康的測定濃度與實際濃度的比值為方法回收率。

1.2.7 精密度測定 每日每種濃度方法回收率各測定5次，計算日內精密度。連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 兩組動物的藥代動力學參數(shù)按統(tǒng)計矩的非隔室動力學理論計算〔4〕，藥-時曲線下面積(AUC)用梯形面積法計算，消除速率常數(shù)(Ke)由藥-時曲線上末端4點求得，最大血藥濃度(Cmax)和最大血藥濃度對應時間(Tmax)采用實測值。以直腸給藥組AUC(0-inf)比靜脈注射組AUC(0-inf)，計算伊立替康中空栓的絕對生物利用度(F)，公式如下:

2 結果

2.1 HPLC色譜圖 在選定條件下測得的色譜圖見圖1。結果顯示，伊立替康的保留時間約為6.1 min。

2.2 標準曲線的繪制 以伊立替康標準品系列濃度對應的峰面積(A)為縱坐標，其系列濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線為A=215.08C－312.90(r=0.999 7，n=6)，結果表明，伊立替康血藥濃度在25～1 000 ng/ml范圍內線性關系良好 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml伊立替康對應的峰面積分別為 6 923、10 441、21 145、53 491、103 647、216 513。以信噪比為3，最低檢測限10 ng/ml。見圖2。

2.3 回收率測定 80、400、800 ng/ml三種濃度的提取回收率分別為(89.08±4.682)%、(90.23±3.668)%、(88.91±2.776)%，相對標準差為5.256%、4.030%、3.120%;方法回收率分別為(107.14±7.163)%、(96.76±5.658)%、(101.46±4.417)%，相對標準差分別為6.69%、5.85%、4.35%。

2.4 精密度測定 80、100、800 ng/ml三種濃度的日內精密度分別為 4.54% 〔(86.11±3.908)%〕、4.66% 〔(398.75±18.572)%〕、2.96%〔(815.69±24.167)%〕。日間精密度分別為 8.35% 〔(85.71 ±7.157)%〕、5.44% 〔(377.48 ±20.548)%〕、5.40%〔(809.58±43.677)%〕。

2.5 藥代動力學分析 家兔靜脈注射60 mg伊立替康和直腸給予160 mg伊立替康后，半衰期(T1/2)、表觀分布容積(Vss)、消除速度常數(shù)(Ke)、機體總清除率(CL)、AUC(0-inf)、峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)見表1。家兔靜脈注射伊立替康后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3，家兔直腸給予伊立替康中空栓后的平均血藥濃度-時間曲線見圖4。伊立替康中空栓的平均絕對生物利用度為11.34%。

圖1 HPLC色譜圖

圖2 血漿中伊立替康的標準曲線

圖3 家兔注射伊立替康后平均血藥濃度-時間曲線

表1 不同伊立替康給藥方式主要藥代動力學參數(shù)(± s，n=5)

表1 不同伊立替康給藥方式主要藥代動力學參數(shù)(± s，n=5)

參數(shù) 伊立替康注射液 伊立替康中空栓T1/2(h)15.599 9±6.479 4 22.505 2±7.282 4 Tmax(h) 1 4 Cmax(μg/ml) 17.853 3±0.906 8 3.065 3±0.178 6 Ke 0.050 1±0.020 9 0.033 4±0.010 7 Vss(ml/kg) 63.889 1±8.938 2 313.207 7±78.420 6 CL(ml·h－1·kg－1) 15.910 0 ±1.850 4 52.528 0 ±4.924 4 AUC(0-inf)(μg·h－1·ml－1)63.419 5 ±7.315 3 19.175 9 ±1.969 3 F(%)－11.34

圖4 家兔直腸給藥伊立替康中空栓劑后平均血藥濃度-時間曲線

3 討論

鹽酸伊立替康目前已被廣泛用于大腸癌、小細胞肺癌以及胃癌等實體瘤的治療中，并經(jīng)臨床試驗證實，其能夠明顯延長患者生存期，但血液學毒性和消化道反應嚴重限制了伊立替康的臨床應用〔5〕。已有研究研究表明，鹽酸伊立替康在動物和人體內的消除方式主要為肝代謝和膽汁分泌〔6〕。與其代謝相關的酶包括羧酸酯酶(CEs)、葡萄糖醛酸轉移酶(UGTs)、細胞色素P450(CYP3A)以及β-葡萄糖苷酸酶等。鹽酸伊立替康在體內外易受羧酸酯酶的影響而轉化為活性代謝產(chǎn)物10-羥基-7-乙基喜樹堿(SN-38)，也能夠通過CYP3A途徑形成無活性的氧化產(chǎn)物。

1984 年日本學者渡道善照首次制備成中空栓劑，其外層為基質制成的殼，空心可填充固體、液體或混懸液狀態(tài)的藥物。為哮喘、糖尿病、貧血和癌癥等慢性病的長期治療提供了適合的劑型，能替代某些注射劑、灌腸劑，劑量準確，應用方便，緩釋的中空栓可減少用藥頻率，增加病人的順應性。

本研究結果表明，伊立替康靜脈給藥的Vss值比直腸給藥的Vss值小很多，說明靜脈給藥的血藥濃度要高于直腸給藥的血藥濃度;伊立替康注射劑在注射后約1 h出現(xiàn)反彈濃度，提示該藥存在肝腸循環(huán)，而伊立替康中空栓在給藥后6～8 h血藥濃度基本不變，與大鼠口服伊立替康后的血藥濃度相似〔4〕;伊立替康直腸給藥后，有一定的生物利用度，提示直腸給藥有可能成為伊立替康的另一給藥途徑。

然而，伊立替康在體內代謝為活性產(chǎn)物SN-38，由于沒有SN-38的標準品，無法同時定量測定。另外，由于伊立替康中空栓含藥量為80 mg/枚，每只家兔用兩枚中空栓，直腸內基質較多，可能影響了伊立替康的吸收。因此，有待于通過進一步研究揭示伊立替康中空栓劑藥代動力及生物利用度的特點。

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2 胡文蔚，王 赫，孫文輝.伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶亞葉酸鈣治療轉移性大腸癌31例臨床觀察〔J〕.中國癌癥雜志，2008;18(1):77-8.

3 孫祥德，高 革，齊 偉，等.高效液相色譜法測定血漿中伊立替康的含量〔J〕.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2005;22(1):57-9.

4 Bansal T，Awasthi A，Jaggi M，et al.Development and validation of reversed phase liquid chromatographic method utilizing ultraviolet detection for quantification of irinotecan(CPT-11)and its active metabolite，SN-38，in rat plasma and bile samples:application to pharmacokinetic studies〔J〕.Talanta，2008;76(5):1015-21.

5 王偉蘭，朱 曼，郭代紅，等.伊立替康臨床應用的安全性研究〔J〕.中國藥業(yè)，2011;20(3):41-2.

6 宋祥珍，曹 斌，張自強，等.伊立替康體內代謝途徑及代謝產(chǎn)物的研究進展〔J〕.西北藥學雜志，2009;24(6):515-7.