糖尿病大鼠腎小管Bcl-2蛋白家族的動(dòng)態(tài)變化

桂華珍 閻秀英 肖 瑛 石明雋 郭 兵 張國(guó)忠*

（1 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

近期的研究表明，腎小管上皮細(xì)胞凋亡在糖尿病腎?。―N）發(fā)病中起重要作用[1,2]，但糖尿?。―M）時(shí)腎小管細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。鑒于Bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié)線粒體途徑依賴的細(xì)胞凋亡，并且其他作者和我們既往研究表明，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）介導(dǎo)了糖尿病腎小管損傷[3,4]，因此本研究旨在觀察鏈尿佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的大鼠DM發(fā)病過(guò)程中，腎小管Bcl-2、Bax和p38MAPK蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并探討其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量170～200g，購(gòu)于上海西普爾-比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0002。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，兩次尿蛋白定性陰性并且空腹血糖在正常范圍內(nèi)者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ，Sigma公司）；血糖檢測(cè)試劑盒（四川邁克科技有限公司 ）；尿蛋白檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Bcl-2和Bax抗體、SABC即用型免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色劑和ECL試劑（武漢博士德公司）；β-actin、p38MAPK和p-p38MAPK抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG（Santa Cruz，USA）。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備

大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（DM）和正常對(duì)照組（N），每組30只，于實(shí)驗(yàn)2、4、8、16和24周處死。從尾靜脈注射溶于pH4.5無(wú)菌檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液的STZ 55mg/kg復(fù)制大鼠模型，于注射后48h空腹血糖值≥16.7mmol/L 且尿糖陽(yáng)性動(dòng)物認(rèn)為糖尿病模型成立。對(duì)照組大鼠尾靜脈注射相應(yīng)量的溶媒。

1.4 標(biāo)本采集

動(dòng)物處死前一天代謝籠收集24h尿液。處死前禁食6～8h，股動(dòng)脈穿刺取血，分離血清。開(kāi)腹取腎臟，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分－80℃保存。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

氧化酶法測(cè)血清葡萄糖；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)尿蛋白濃度，其與24h尿量乘積為24h尿蛋白排泄量。

1.6 腎組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)

取多聚甲醛固定的腎臟制作石蠟切片，行免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)。Bcl-2和Bax一抗工作濃度均為1∶100。用PBS液代替一抗，作為陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡觀察細(xì)胞漿有棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)腎皮質(zhì)10個(gè)不重復(fù)視野的免疫染色陽(yáng)性腎小管數(shù)，取均值。

1.7 Western blot 檢測(cè)

取-80℃保存的腎皮質(zhì)加裂解液充分勻漿，離心取上清液上樣，經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。p38MAPK和p-p38MAPK一抗?jié)舛葹?∶200，β-actin一抗?jié)舛葹?∶300。ECL試劑曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析（Bio-Rad），以靶蛋白/β-actin灰度比值表示靶蛋白的相對(duì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，糖尿病組與對(duì)照組間資料比較采用t檢驗(yàn)，糖尿病兩組間資料比較采用單因素方差分析，用Pearson方法分析相關(guān)性，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組動(dòng)物血糖和尿蛋白變化

與正常對(duì)照組比較，DM大鼠血糖明顯升高，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直維持于相對(duì)穩(wěn)定的高水平（表1）。糖尿病2周24h 尿蛋白量明顯高于對(duì)照組，且隨著病程的進(jìn)展呈進(jìn)行性增多，見(jiàn)表1。

表1 大鼠血糖和24 h尿蛋白量變化 (±s，n=6)

表1 大鼠血糖和24 h尿蛋白量變化 (±s，n=6)

注：*正常組比較P＜0.01；▲與上一時(shí)點(diǎn)比較P＜0.05

DM N DM 2周 6.72±2.42 20.42±5.11* 2.01±1.21 23.36±8.91*4周 7.61±0.55 24.07±3.52* 5.28±2.31 32.30±8.35*▲8周 7.89±1.34 26.36±2.02* 7.73±1.22 27.26±8.51*16周 8.04±0.32 26.70±2.16* 7.65±1.24 49.38±10.86*▲24周 7.95±1.09 25.32±4.13* 8.76±1.19 55.37±3.22*▲組別 血糖值 (mmol/L) 24h尿蛋白(mg)N

2.2 Bax和Bcl-2蛋白在腎小管的表達(dá)

腎組織免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白有少量表達(dá)，糖尿病各組兩者表達(dá)均顯著增高。Bax蛋白隨糖尿病進(jìn)展而增多，糖尿病8、16和24周組Bax蛋白表達(dá)顯著高于糖尿病2周組。糖尿病2和4周組Bcl-2表達(dá)相似，處于高水平，然而8周開(kāi)始其表達(dá)減少，但24周仍然遠(yuǎn)高于對(duì)照組。Bax/Bcl-2比值隨糖尿病病程進(jìn)展而增高（表2和圖1、2）。

表2 Bax和Bcl-2蛋白在腎小管的表達(dá) (±s，n=6)

表2 Bax和Bcl-2蛋白在腎小管的表達(dá) (±s，n=6)

注：*與正常組比較P＜0.01； ◆與糖尿病2周組比較P＜0.05； ▲與前一時(shí)點(diǎn)比較P＜0.05

Bcl-2 Bax/Bcl-2 N DM N DM DM 2周 0.05±0.08 6.83±1.25* 0.32±0.10 13.56±3.25* 0.47±0.14 4周 0.03±0.05 8.31±1.77* 0.14±0.05 13.68±2.51* 0.64±0.21 8周 0.08±0.10 9.45±2.01*◆ 0.21±0.10 10.25±2.20*◆ 1.02±0.25▲16周 0.08±0.13 11.92±3.33*◆ 0.33±0.34 8.90±2.61* ◆ 1.42±0.27▲24周 0.08±0.11 13.12±1.76*◆ 0.18±0.13 8.64±1.96*◆ 1.78±0.45▲組別 Bax

表3 大鼠腎皮質(zhì)p38 MAPK and p-p38MAPK 蛋白相對(duì)水平 (±s，n=6)

表3 大鼠腎皮質(zhì)p38 MAPK and p-p38MAPK 蛋白相對(duì)水平 (±s，n=6)

注：*與對(duì)照組比較 P＜0.01

對(duì)照 DM2周 DM4周 DM8周 DM16周 DM24周p38MAPK 0.16±0.02 0.23±0.06 0.88±0.14* 0.82±0.10* 0.87±0.08* 0.89±0.12*p-p38MAPK 0.00±0.00 0.08±0.02* 0.54±0.07* 0.75±0.12* 0.69±0.06* 0.66±0.09*

2.3 p38MAPK和p-p38MAPK表達(dá)

大鼠腎皮質(zhì)Western blot結(jié)果表明，對(duì)照組可檢測(cè)到少量p38MAPK蛋白，未檢測(cè)到p-p38MAPK蛋白。DM2周 p38MAPK蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相似，但可檢測(cè)到p-p38MAPK蛋白表達(dá)。DM4周時(shí)p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均明顯高于對(duì)照組和DM2周，并且在8、16和24周均維持于高水平（表3和圖3）。相關(guān)性分析表明，p-p38MAPK蛋白與Bax/Bcl-2比值呈顯著正相關(guān)（r=0.512，P＜0.05）。

3 討 論

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射STZ后動(dòng)物血糖明顯升高，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均維持在高水平，表明動(dòng)物發(fā)生了糖尿病。同時(shí)，在DM2周出現(xiàn)蛋白尿，并且呈進(jìn)行性增多，表明并發(fā)了糖尿病腎病或謂糖尿病腎疾?。―KD）。

DM2周腎小管Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，并且Bax蛋白隨DM病程進(jìn)展呈進(jìn)行性增多，而B(niǎo)cl-2蛋白從DM8周開(kāi)始減少。Bax/Bcl-2比值在DM2和4周＜1，8周接近1，16和24周則＞1。Bcl-2和Bax蛋白同屬Bcl-2蛋白家族，但作用相反，前者使細(xì)胞存活而后者引起線粒體途徑依賴的細(xì)胞凋亡。通常Bax與Bcl-2互為結(jié)合蛋白以相互拮抗的異二聚體形式存在于胞漿，兩者比值決定著細(xì)胞命運(yùn)，Bax/Bcl-2比值＞1時(shí)使細(xì)胞凋亡[5]。

p38MAPK為絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員，其活性形式即磷酸化形式p-p38MAPK介導(dǎo)多種生理和病理過(guò)程。有研究表明，p-p38MAPK使Bax蛋白激活并轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，使其通透性增高并釋放細(xì)胞色素C和caspase-3而執(zhí)行細(xì)胞凋亡[6]。Rane MJ等研究表明，大鼠糖尿病6個(gè)月時(shí)，p-p38MAPK表達(dá)增多致腎小管上皮細(xì)胞凋亡[7]。Khera 等的研究表明，高糖使Bax蛋白表達(dá)增多而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)減少，Bax/Bcl-2比值增高，從而使系膜細(xì)胞凋亡[8]。我們的結(jié)果顯示，DM2周p38MAPK表達(dá)增多且檢測(cè)到其活性形式p-p38MAPK，此后隨病程進(jìn)展p38MAPK表達(dá)和活化進(jìn)一步增加，DM8周后維持在高水平，并且p-p38MAPK與Bax/Bcl-2比值呈正相關(guān)。鑒于我們過(guò)去的研究表明，在糖尿病大鼠腎皮質(zhì)，p38MAPK主要表達(dá)于腎小管[4]，因此目前的研究提示了，糖尿病早期腎小管p38MAPK表達(dá)已增加及部分活化，并且在DM病程發(fā)展過(guò)程中持續(xù)高活性的p-p38MAPK可能介導(dǎo)了腎小管Bax蛋白表達(dá)增多和Bcl-2蛋白表達(dá)減少，使Bax/Bcl-2比值增高，從而參與糖尿病腎病的病理過(guò)程。

然而，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，在DM2周時(shí)Bcl-2增高十分顯著，即使此后隨糖尿病病程進(jìn)展而有所減少，但在DM24周依然顯著高于對(duì)照組，提示在糖尿病發(fā)病過(guò)程中尚有其他機(jī)制在促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

[1]Magri CJ,Fava S.The role of tubular injury in diabetic nephropathy[J].Eur J Intern Med,2009,20(6)：551-555.

[2]Verzola D,Gandolfo MT,Ferrario F,et al.Apoptosis in the kidneys of patients with type Ⅱ diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2007,72(12)：1262-1272.

[3]Lim AK,Nikolic-Paterson DJ,Ma FY,et al.Role of MKK3-p38MAPK signaling in the development of type Ⅱ diabetes and renal injury in obese db/db mice[J].Diabetologia,2009,52(2)：347-358.

[4]萬(wàn)昌武,肖瑛,石明雋,等.糖尿病大鼠腎小管P選擇素和MCP-1的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制探討[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2007,31(5)：440-443.

[5]Toule RJ,Strasser A.The Bcl-2 protein family： opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(1)：47-59.

[6]Owens TW,Valentijn AJ,Upton JP,et al.Apoptosis commitment and activation of mitochondrial Bax during anoiks is regulated by p38MAPK[J].Cell Death Differ,2009,16(11)：1551-1562.

[7]Rane MJ,Song Y,Jin SY,et al.Interplay between Akt and p38MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(1)：F49-F61.

[8]Khera T,Martin J,Riley S,et al.Glucose enhances mesangial cell apoptosis[J].Lab Invest,2006,86(5)： 566-577.