制備SD大鼠云南白藥含藥血清的實(shí)驗(yàn)條件篩選

張 瑩 李瑪琳,2* 羅 敏 周軼平 張 昕

（1 昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2 云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

在眾多具有治療跌打損傷、強(qiáng)筋健骨的中藥中，云南白藥被譽(yù)為“中華瑰寶，傷科圣藥”，自發(fā)明至今一百多年來(lái)，其獨(dú)特的療效名揚(yáng)海內(nèi)外。1984年日本學(xué)者田代真一提出含藥血清實(shí)驗(yàn)方法，“含藥血清”即給動(dòng)物或人服用一定量的藥物后，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間采血所獲得的血清。使用云南白藥含藥血清來(lái)進(jìn)行科研實(shí)驗(yàn)不僅有助于骨修復(fù)的研究更是對(duì)中藥作用的作用機(jī)制進(jìn)行了更深的探討。大鼠腹主動(dòng)脈取血[1]是常用的制備血清的方法，其中很多條件都直接影響血清的制備是否成功，作者經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期大量實(shí)驗(yàn)得到最佳的制備含藥血清的實(shí)驗(yàn)條件，現(xiàn)從水浴時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間和離心溫度方面進(jìn)行篩選加以證明，以供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年SD大鼠200只；云南白藥粉劑；生理鹽水；負(fù)壓采血管；水浴鍋；常溫離心機(jī)；低溫離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選擇健康SD大鼠200只，體質(zhì)量（200±20）g，雌性，常溫飼養(yǎng)，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”[2]配置云南白藥溶液，連續(xù)4d給藥，給大鼠灌胃的云南白藥劑量相當(dāng)于臨床成人等效劑量（36mg/d），前3 d每日劑量分2次灌胃，第4天禁食12h后一次性灌服全天劑量[3]，1h后用質(zhì)量濃度2%，即0.2mL/100g體質(zhì)量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，參照車兆義[4]等報(bào)道的方法腹主動(dòng)脈取血與負(fù)壓采血管中，每只大鼠取2管血每管約4mL，每種條件做篩選時(shí)其他條件保持不變，擬設(shè)37℃水浴15min后常溫下3000r/min離心15min為參考條件后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)條件的篩選

2.1 水浴時(shí)間

取100管成功采得血樣，隨機(jī)分為4組每組25管，進(jìn)行：靜置5min；37℃水浴5min；37℃水浴15min；37℃水浴30min，4種處理。后常溫下3000r/min離心15min，結(jié)果：靜置組12管分離成功，13管出現(xiàn)溶血（圖1）或分離不徹底現(xiàn)象（圖2）；5 min組全部出現(xiàn)溶血或分離不徹底現(xiàn)象；15min組全部成功分離（圖3）；30 min組4組成功，21管出現(xiàn)溶血或分離不徹底現(xiàn)象。

2.2 離心轉(zhuǎn)速

取120管成功采得血樣，隨機(jī)分為3組每組40管，37℃水浴15min，后進(jìn)行1000 r/min；3000 r/min；5000r/min，3種處理。常溫下離心15min，結(jié)果：1000r組15min后，全部分離不徹底，又繼續(xù)進(jìn)行15min離心，其中28管分離出少量血清，12管溶血或仍分離不徹底；3000 r組39管分離成功，1管分離不徹底；5000 r組15min后全部溶血。

2.3 離心時(shí)間

取90管成功采得血樣，隨機(jī)分為3組每組30管，37℃水浴15min，3000r/min常溫下離心，分別設(shè)置5min；15min；30min，3種處理。結(jié)果：5min組全部分離不徹底或分離不開；15min組全部成功分離；30min組11管成功分離，19管出現(xiàn)溶血。

2.4 離心溫度

取90管成功采得血樣，隨機(jī)分為2組每組45管，37℃水浴15min，分別進(jìn)行3000r/min常溫離心15min和3000r/min低溫（4℃）離心15min兩種處理。結(jié)果：低溫組全部成功分離；常溫組1管出現(xiàn)分離不徹底，其余成功分離。

3 結(jié)果與討論

含藥血清相較中藥粗制劑體外實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在復(fù)方藥物的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化效應(yīng)和克服了藥物本身理化性質(zhì)（如雜質(zhì)、酸堿度、滲透壓、pH值等）對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾[5]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采血制備含藥血清過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)條件的選擇是不容忽視的方面，不恰當(dāng)?shù)臈l件直接影響到血清制備的成敗和量的多少，而失敗的實(shí)驗(yàn)不僅會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度也會(huì)造成不必要的資源浪費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)對(duì)分離血清時(shí)的各種條件篩選后得出：采得血樣后進(jìn)行水浴有助于血清的分離成功，且水浴的時(shí)間在15～20min最為合適，時(shí)間過(guò)短起不到凝結(jié)沉淀血細(xì)胞的效果，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[6]容易導(dǎo)致溶血。離心轉(zhuǎn)速在3000r/min為宜，太慢會(huì)導(dǎo)致分離不徹底且時(shí)間太久容易出現(xiàn)溶血，太快易導(dǎo)致血細(xì)胞破碎而出現(xiàn)溶血。離心時(shí)間15min最為合適，太長(zhǎng)和太短都不利于血清的分離。另外發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)血清的分離可能沒(méi)有直接的影響，實(shí)驗(yàn)表明常溫和低溫下離心都可以成功分離血清。作者認(rèn)為在符合自己實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的基礎(chǔ)上應(yīng)盡可能減少大鼠使用量和提高血液的利用率，選擇正確的實(shí)驗(yàn)條件能有效地提高實(shí)驗(yàn)效率和降低試驗(yàn)成本，以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

4 結(jié) 論

經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)證明，就本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，分離大鼠云南白藥含藥血清37℃水浴15min后常溫下3000r/min離心15min的條件是最佳條件，其余實(shí)驗(yàn)條件搭配勻在一些方面存在瑕疵，應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和要求來(lái)選擇和注意。

[1]羅衛(wèi)國(guó),張偉.大鼠兩種采血方法介紹[J].第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,22 (1)：26.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民軍醫(yī)出版社,2006：附錄1861.

[3]張慧,班立麗,楊兵兵,等.云南白藥含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響[C].2006第六屆中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集,2006.

[4]車兆義,鄒 悅,宋清斌.大鼠實(shí)驗(yàn)中幾種常用的采血方法探討[J].局解手術(shù)學(xué)雜志, 2008,17(2)：84-85.

[5]劉成海.中藥復(fù)方體外藥理研究思考[J].中藥新藥與臨床藥理,2000,11(1)：53-56.

[6]劉冰.夏季分離血清的時(shí)間對(duì)速率法測(cè)定酶活性的影響[J].四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào),1995,15(4)：58.