阿爾茨海默病患者血漿NO、ox-LDL 3-NT的臨床研究

彭 譽， 趙 中

阿爾茨海默病(Alzheimer’disease，AD)是一種常見的中樞神經退行性疾病，其發病率呈逐年增高趨勢，嚴重威脅人民的生活健康。研究顯示，氧化應激與硝化應激與癡呆的發病密切相關，氧化應激與硝化應激產物，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、3-硝基絡氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)廣泛存在于神經退行性疾病中［1］。另外，AD患者神經元的缺失與氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)有密切關系［2］。本實驗旨在研究AD患者血漿NO、ox-LDL和3-NT水平并作相關性分析，從而了解其在AD發病過程中的作用及其可能的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 于2011年1月～2012年3月入住我院神經內科治療的AD患者中隨機抽取48例為研究對象，AD診斷參照美國精神醫學會的《精神障礙診斷的統計手冊》即 DSM-Ⅳ-R診斷標準［3］:(1)認知功能障礙:A.記憶力障礙(包括近的和遠的記憶力障礙);B.認知功能損害至少具備下列一項，即失語、失用、失認、抽象思維和判斷力損害。(2)上述兩種認知功能障礙明顯干擾了職業和社會活動或與個人以往相比明顯減退。(3)不只是發生在譫妄病程之中。(4)上述損害不能用其他的精神及情感性疾病解釋。(5)所有患者經完整的神經系統體檢無局灶陽性體征。同時收集健康受試者37例(NC組)，所有受試者均符合:(1)簡明精神狀態量表(MMSE)評分正常(＞24分);(2)性別、年齡、教育程度、血液相關生物學指標相匹配的健康體檢人員。所有研究對象均獲知情同意。兩組研究對象基本情況(見表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 神經心理量表的測定 (1)簡易精神狀態檢查量表(Mini Mental State Examination，MMSE):對兩組的智能損害進行篩選，根據文盲、小學、中學、大學等不同的文化程度，分別以MMSE評分≤17、20、22、23分為入選AD組標準。(2)日常生活能力量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)共20項，用于輔助評估病情輕重程度。評分標準為4級:1分代表自己可以做;2分為有些困難;3分為需要幫助;4分為根本沒法做。(3)Hachinski缺血指數(Hachinski Ischemic Scale，HIS)共13項，用于鑒別AD與VD。評分越高越支持VD:≥7分支持VD診斷;≤4分支持AD診斷。(4)癡呆嚴重程度根據全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)分級。GDS評分:3、4分者為輕度組。5分為中度組;6、7分為重度組。

1.2.2 血液標本的采集和測定 患者入組后，于清晨抽取空腹靜脈血2ml，肝素抗凝，1500r/min離心10min，完全分離血漿，保存于-80℃冰箱待測。采用雙抗夾心酶聯免疫吸附(ELISA)NO試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國)、抗人 3-NT ELISA試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國)、抗人ox-LDL ELISA試劑盒(adlitteram diagnostic laboratories，美國)測定血漿 NO、3-NT、ox-LDL濃度。檢測方法嚴格按照實驗設計步驟。AD組和NC組的血糖、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、總蛋白、白蛋白等基本生化指標均經我院檢驗科檢測(見表1)。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，樣本間男女構成比較采用χ2檢驗;其它臨床特點及指標均數比較采用t檢驗;相關性分析應用Pearson相關分析，檢驗水準設α=0.05。

2 結果

2.1 兩組基本情況(見表1)。NC組和AD組的性別構成、年齡、受教育年限、基本生物學指標比較，差異無統計學意義(P ＞0.05)。MMSE、ADL、HIS、GDS評分(見表2)。NC組MMSE、ADL評分與AD組比較，差異有統計學意義(均 P=0.000)。HIS、GDS評分僅作PD確診及嚴重程度評價。依據GDS評分AD組患者分為3亞組:輕度AD組(11例)、中度AD組(20例)、重度AD組(17例)。

2.2 血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度測定結果兩組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度測定結果見(見表3)。t檢驗結果顯示，AD組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度分別高于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 不同程度AD患者血漿NO、ox-LDL和3-NT濃度的比較以及等級相關分析 各AD亞組及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度(見表4)。方差分析顯示各AD亞組及NC組患者血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度有差異;進一步的多重分析(SNK法)顯示輕、中、重度AD組的血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度顯著高于NC組。不同嚴重程度AD組患者之間血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度隨著病情加重而升高，組間差異有統計學意義(P＜0.05)。將NC組及AD組患者分成4個等級:以NC為0級、輕度AD為1級、中度AD為2級、重度AD為3級。分析血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與AD嚴重程度之間的相關關系(Spearman相關分析法)，結果顯示血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與AD的嚴重程度呈正相關，即隨著癡呆嚴重程度的增加，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度呈上升趨勢(見表5)。

2.4 血漿NO、3-NT和 ox-LDL濃度 AD MMSE評分線性相關分析 輕度AD組MMSE評分(17.2±5.8)分;中度 AD組患者 MMSE評分(13.3±5.6)分;重度 AD 組患者 MMSE 評分(11.4±6.2)分。Spearman相關分析結果顯示血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度與MMSE評分存在負相關性(P＜0.05)，即隨著MMSE評分的減少，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度呈上升趨勢(見表6)。

2.5 AD 組內 NO、3-NT、ox-LDL 濃度之間的線性相關分析 Pearson相關分析顯示:AD組中血漿NO濃度與3-NT濃度呈正相關，即隨著血漿NO濃度的增高，血漿3-NT濃度升高，而血漿NO、3-NT濃度與血漿ox-LDL濃度之間不存在相關關系(見表7)。

表1 NC組、AD組基本情況比較(±s)

表1 NC組、AD組基本情況比較(±s)

兩組間比較*P＞0.05

項目 NC組(n=37) AD組(n=48) χ2值 P值年齡(歲)受教育程度(年)吸煙［n(%)］血糖(mg/dl)總膽固醇(mg/dl)高密度脂蛋白(mg/dl)低密度脂蛋白(mg/dl)三酰甘油(mg/dl)總蛋白(g/dl)白蛋白(g/dl)尿酸(mg/dl)肌酐(mg/dl)谷丙轉氨酶(U/L)谷草轉氨酶(U/L)乳酸脫氫酶(U/L)維生素B12(pg/ml)葉酸(ng/ml)游離甲狀腺素4(ng/dl)促甲狀腺素(m IU/ml)C-反應蛋白(mg/dl)胰島素(mU/ml)血紅蛋白(g/dl)71.06 ±5.87 7.89 ±5.65 18(50.1%)101.1 ±10.3 213.6 ±48.9 57.8 ±14.6 136.8 ±16.4 89.4 ±36.8 7.57 ±0.26 3.91 ±0.18 32.8 ±18.2 1.10 ±0.17 21.6 ±4.4 20.1 ±6.9 173.5 ±45.6 9.5 ±5.3 13.5 ±4.5 1.07 ±0.18 1.18 ±0.54 2.75 ±1.63 8.91 ±2.94 11.2 ±1.9 69.32 ±5.53 6.37 ±6.58 24(44.3%)94.5 ±10.2 204.5 ±20.3 45.9 ±10.3 138.2 ±34.7 125.2 ±45.8 7.50 ±0.43 3.86 ±0.22 38.8 ±13.1 0.98 ±0.27 20.3 ±4.3 15.9 ±7.2 209.6 ±66.7 8.6 ±3.9 10.2 ±4.3 0.99 ±0.23 1.04 ±0.25 2.59 ±1.97 10.2 ±3.34 9.9 ±1.5 1.181 0.234 0.82 2.132 2.452 0.986 1.221 0.847 0.112 0.213 0.544 0.099 0.432 0.256 2.001 0.101 0.223 0.113 0.167 0.184 0.256 0.302 0.243*0.672*0.347*0.164*0.062*0.453*0.178*0.321*0.2341 0.1741 0.1391 0.0821 0.1531 0.2611 0.4211 0.1311 0.1461 0.0981 0.1031 0.2071 0.3861 0.2351

表2 NC組與 AD 組 MMSE、ADL、HIS、GDS評分比較(±s)

表2 NC組與 AD 組 MMSE、ADL、HIS、GDS評分比較(±s)

兩組間比較*P＜0.05;*僅用來評價AD患者病情輕重和分級

項目 NC組(n=37) AD組(n=48) χ2值 P值MMSE評分ADL評分HIS評分*GDS評分*27.2 ±1.01 13.25 ±2.30--14.2 ±5.33 20.82 ±4.31 1.32 ±1.52 6.35 ±4.62 11.32 10.75--0.000*0.000*--

表3 NC組和AD組血漿NO、ox-LDL及3-NT濃度比較(±s)

表3 NC組和AD組血漿NO、ox-LDL及3-NT濃度比較(±s)

項目 AD組 NC組 P值NO濃度(μmol/L)3-NT濃度(nmol/L)ox-LDL濃度(μg/L)41.01 ±16.40 119.46 ±21.82 112.25 ±17.81 15.97 ±6.63 55.09 ±9.63 47.46 ±10.04 0.000 0.000 0.000

表4 不同程度AD患者及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的比較(±s)

表4 不同程度AD患者及NC組血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的比較(±s)

與NC組比較*P＜0.05

組別 NO濃度(μmol/L) 3-NT濃度(nmol/L) ox-LDL濃度(μg/L)NC組(n=37)輕度AD組(n=11)中度AD組(n=20)重度AD組(n=17)FP 15.97 ±6.63 25.82 ±5.331*35.34 ±13.461*57.26 ±7.841*87.962 0 55.09 ±9.63 106.47 ±5.851*114.52 ±14.651*133.82.±27.471*124.365 0 47.46 ±10.04 101.51 ±4.791 107.64 ±14.931*126.02 ±18.261*186.33 0

表5 血漿NO、3-NT、ox-LDL與AD的嚴重程度之間的Spearman相關分析(n=48)

表6 AD患者血漿NO、3-NT、ox-LDL濃度MMSE得分之間的Spearman相關分析(n=48)

表7 AD組內血漿NO、3-NT、ox-LDL濃度之間的線性相關分析r值(Spearman相關分析)

3 討論

硝化應激即蛋白質的硝化作用，是指由NO或由NO衍生的活性氮族(reactive nitrogen species，RNS)與活性氧族(reactive oxygen species，ROS)共同聯合發生的生物化學作用［4］，使細胞內蛋白質中的酪氨酸硝化成3-NT，引起細胞損傷或凋亡，從而對細胞產生多種毒性作用的病理狀態。硝化應激的標志物主要為 RNS，RNS指的是 NO、亞硝酸(nitrous acid，HNO2)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO-)、二氧化氮(nitrogen dioxide，NO2)等，3-NT的形成被認為是體內RNS形成的生物標志［1］。RNS的形成離不開ROS，氧化應激狀態下RNS/ROS水平的升高將導致蛋白質的硝化。硝化應激與氧化應激密切相關的、活性氮及活性氧聯合反應引起的蛋白質翻譯后修飾，且與氧化應激密切相關的活性氧如超氧陰離子(superoxide anion，O2-)、羥自由基(hydroxyl free radical，·OH)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、NO等與活性氮的生成和清除途徑相交疊并互相調節［5］。當體內發生氧化應激時，產生大量的NO和活性氧。一方面NO和O2-反應生成過氧亞硝酸根離子ONOO-，它既可以作為硝化劑，又可以作為強氧化劑，與蛋白質、脂質、核酸等生物大分子反應;另一方面NO的氧化產物亞硝酸鹽與H2O2共存時，在過氧化物酶的催化下，也能作為硝化劑和氧化劑損傷蛋白質及核酸。因此，蛋白質硝化和氧化應激作用能影響蛋白質的2、3、4級結構，進而影響細胞的信號傳導、細胞骨架、酶催化作用，產生炎癥反應，影響細胞的生存，參與 AD的發病［6］。

本實驗顯示AD患者血漿NO、3-NT濃度顯著高于正常對照組(P＜0.05和 P＞0.05)，這與國外一些文獻報道的結果一致［7，8］，Sinem［7］等對 15 例未接受任何治療的AD患者和對62例接受抗膽堿之酯酶抑制劑和抗精神失常藥物治療研究發現，未接受治療AD患者血漿NO、3-NT顯著增高，短期接受抗膽堿酯酶抑制劑治療的患者血漿NO濃度較長期接受抗膽堿酯酶抑制劑顯著降低。這與AD患者氧化應激導致iNOS量和活性的增加，進而導致血漿NO濃度的升高，而過多的 NO 可進一步生成3-NT［7，9］。但一些研究顯示［10，11］，AD 患者血漿 NO、3-NT 濃度未顯著發生變化，甚至是降低，其可能的原因有:所取標本時間過長，由eNOS、nNOS催化生成的NO半衰期僅數秒，而由iNOS產生的NO半衰期也就數小時，測量時NO已經代謝分解，產生3-NT原料減少，同時抗膽堿酯酶抑制劑的治療也能影響結果［10］。本研究還發現AD患者血漿NO、3-NT濃度與MMSE評分成負相關，即AD患者血漿NO、3-NT濃度越高，MMSE評分越低，提示血漿NO、3-NT濃度可以反映AD患者認知功能損害程度，而且血漿NO濃度與3-NT濃度呈正相關。推測其機制可能為:(1)阿爾茨海默病的發病機制與氧化應激密切相關，當機體受到感染、疾病或環境等的影響時，機體氧化水平超過抗氧化水平、活性氧簇和活性氮簇等高活性的分子就會大量堆積，而高濃度的NO參與β淀粉樣蛋白(amyloidβprotein，Aβ)的神經毒性作用，導致AD的產生［12］。(2)研究顯示，AD患者存在明顯的內顳葉結構病變，包括海馬結構、杏仁核和海馬旁回，而這些位置的糖代謝效率較高，對氧的需求最高，線粒體氧化磷酸化的同時能產生大量的氧自由基和氮自由基，而上述結構清除自由基和抗氧化能力較差，而這些部位是腦認知功能重要的結構基礎，其損害程度與認知功能下降幅度相關［13］。當各種危險因素導致上述部位損害時，損害愈重，認知功能下降愈明顯，NO、3-NT升高也越顯著。

腦內膽固醇主要以非酯化形式存在于髓鞘、星形膠質及神經細胞膜，主要參與髓鞘的構成。現階段普遍認為膽固醇在腦內自體合成，腦外膽固醇對腦組織膽固醇含量無明顯影響，而腦組織多余的膽固醇會轉移到外周?研究顯示，腦組織膽固醇含量改變會影響淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和 Aβ 的表達量，參與 AD 的發病［14］。研究顯示，神經退行性病變，尤其AD患者腦組織膽固醇轉移增加，但完整的血腦屏障會限制膽固醇從腦組織到周圍血液循環的直接運輸.膽固醇需要依靠相關脂蛋白作為載體才能轉出腦組織，尤其是主要分布于腦組織和脈絡膜周圍的低密度脂蛋白(LDL)能通過血腦屏障［14］。在AD中，變性的神經元和突觸釋放膽固醇含量增加，而脂質蛋白更對氧化應激和神經毒性更加敏感，形成穩定的氧化脂蛋白［15］。本研究顯示，AD患者血漿ox-LDL濃度顯著高于正常對照組(P＜0.05)，同時AD患者血漿ox-LDL濃度與MMSE評分成負相關，可能與AD患者腦組織膽固醇轉移增加，低密度脂蛋白含量增加，在氧化應激和硝化應激環境下，低密度脂蛋白更易被氧化，導致含量增加［14］。Konukoglu［16］等對 30 例 AD 患者、20例血管性癡呆患者以及15例認知功能正常患者研究發現，AD患者血漿ox-LDL濃度較兩對照組顯著升高，而Zafrilla［17］等的研究發現，輕中度AD患者血漿ox-LDL濃度，而重度AD患者變化不明顯，而Sinem［7］等在2010年的研究結果同樣支持本結論?本實驗顯示AD患者血漿NO、3-NT濃度分別與血漿ox-LDL濃度之間不存在相關關系原因還有待于進一步研究，可能與三者參與AD起病機制不同有關?但Konukoglu［16］等研究AD患者血漿ox-LDL與血漿NO存在正相關，而與3-NT無關，而Sinem［7］等研究發現AD患者血漿NO水平與3-NT、ox-LDL存在正相關性，這可能與ox-LDL能增加氧化活性物質的形成，促進星形膠質細胞、小膠質細胞的增值、分化以及炎性因子的形成，進而加劇氧化應激和硝化應激有關［18］。

總之，NO、3-NT和ox-LDL在氧化應激和硝化應激過程中起著重要作用，作為AD發病過程的重要因素，與AD患者的病情嚴重程度密切相關，血漿NO、3-NT和ox-LDL濃度的測定有可能作為診斷AD的手段之一，對AD的診斷可能有著一定的意義。

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