重組腺病毒介導(dǎo)的血管生長素基因轉(zhuǎn)染對大鼠局灶性腦缺血的治療作用

唐春花 郭淮蓮， 唐文雄， 張偉赫

腦缺血后腦內(nèi)血管生成情況與神經(jīng)功能恢復(fù)有著密切的相關(guān)性。Krupinski等［1］研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者缺血腦區(qū)微血管密度顯著增加，梗死區(qū)域新生血管數(shù)目越多則患者存活時間越長。治療性血管生成的概念日益受到重視，通過重組腺病毒方式將促血管生成的基因轉(zhuǎn)染到腦組織從而刺激和誘導(dǎo)血管增生成為目前治療缺血性腦血管病的研究熱點，為治療缺血性腦血管病開辟了一條全新的思路［2］。血管生長素(angiogenin，ANG)是一種有效的促血管生長因子，具有很強的誘導(dǎo)新生血管生成和生長的作用［3］。研究已經(jīng)證實，外源性給予ANG能刺激缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)形成和增加局部血流，減少細胞凋亡，明顯改善動物肢體缺血［4］和心肌缺血［5］。ANG 對缺血腦組織的作用目前報道尚少。本研究利用大鼠腦缺血再灌注模型，采用側(cè)腦室內(nèi)注射方式轉(zhuǎn)染Ad-ANG，探討ANG基因轉(zhuǎn)染對大鼠損傷腦組織的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠32只，體重280～330g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。隨機分成重組血管生長素腺病毒治療組(Ad-ANG治療組，含綠色熒光蛋白基因)和重組綠色熒光蛋白腺病毒處理組(Ad-GFP對照組)，每組16只。兩組均在大腦中動脈阻塞再灌注術(shù)后24h經(jīng)側(cè)腦室注射相應(yīng)的重組腺病毒。

1.2 藥品、試劑及儀器 重組血管生長素腺病毒(Ad-ANG，含GFP基因)及重組綠色熒光蛋白腺病毒 Ad-GFP(Biosea)，2.5X1011pfu/ml。兔抗大鼠ANG多克隆抗體(Santa Cruz)，兔抗大鼠vWF多克隆抗體(Abcom)，二步法免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)公司)，TUNEL試劑盒(R＆D)。儀器:Leica DM RXA顯微鏡(德國)。

1.3 大鼠線栓法腦缺血再灌注模型［6］及側(cè)腦室注射［7］大鼠10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔麻醉后取仰臥位，做頸部前正中切口，分離暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈及翼腭動脈，用微動脈夾暫時夾閉頸總動脈，結(jié)扎翼腭動脈，并在頸外動脈近心端、遠心端分別穿線，遠心端系緊，近心端系一個松結(jié)(備用)，在頸外動脈的兩線間剪一個小口，將預(yù)先制備好的線栓，經(jīng)小口插入頸外動脈并送入頸內(nèi)動脈，插入深度(距頸總動脈分叉處)為(18.5±1.5)mm。外留1cm長尼龍線，縫合皮膚。栓塞90min后拔除尼龍線，此時血流再通，制成腦缺血再灌注模型。動物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時右側(cè)前肢內(nèi)收屈曲;同側(cè) Horner征;爬行時向右劃圈;站立時右側(cè)傾倒。凡具有上述4項體征者列入研究對象。

缺血再灌注后24h行側(cè)腦室注射。將鼠固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，以顱骨面人字為體表標志，參照腦立體定位圖譜，取前囟后0.8mm、左旁開1.2mm，牙科鉆垂直鉆孔，用微量加樣器分別抽吸10μl的Ad-ANG或Ad-GFP垂直進針5mm，緩慢注入側(cè)腦室，注射時間10min，留針5min后緩慢拔出。

1.4 神經(jīng)功能缺失評分 參照 Zea-Longa法［8］進行神經(jīng)病學(xué)評分，即無神經(jīng)損傷癥狀為0分，不能完全伸展對側(cè)前爪1分，行走時身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走時向偏癱側(cè)傾倒或動物不能站立或動物打滾為3分，無自發(fā)活動、有意識障礙為4分。采用雙盲法于缺血再灌注時、側(cè)腦室注射時及注射后1d、3d、7d、14d 評分并記錄。

1.5 制備大鼠腦組織切片行熒光檢測及HE染色 大鼠腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管灌注。在相應(yīng)的時間點將每組大鼠快速灌流生理鹽水250ml(37℃)，再用4%多聚甲醛溶液300ml(4℃)灌流，維持20～30min，迅速取出腦。在大鼠腦切片器中沿視交叉冠狀位切取腦組織，將其置于4%多聚甲醛4℃過夜，換20%蔗糖浸泡至沉底，再換30%蔗糖，待腦組織沉底后 OCT包埋，冰凍切片，制成20μm厚的切片，每隔5張取連續(xù)5張貼片，每只大鼠取5張腦片于熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。另取一套腦切片行常規(guī)HE染色，脫水封片后于光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測ANG陽性細胞切片入0.01mol/L PBS水化30min，3%過氧化氫10min，血清封閉1h(室溫)，滴加 ANG(1∶100)抗體50μl于各切片上，入4℃冰箱過夜。次日滴加二抗，室溫下孵育1h。各步驟間均入0.01mol/L PBS搖洗3次，DAB顯色，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并計數(shù)ANG陽性細胞。于室管膜周圍計數(shù)固定得2個高倍視野，缺血皮層下計數(shù)3個高倍(×40)視野，每組大鼠測量8張腦片，每張腦片選取固定得相同的5個位置點。

1.7 微血管密度檢測 采用兔抗大鼠vWF抗體(1∶800)及改良二步法試劑盒，進行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，封片觀察。微血管密度(MVD)計數(shù)按 Weidener等［9］方法進行，凡染成棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為一個血管計數(shù)，每張切片在同一皮層缺血區(qū)選擇5個高倍視野進行微血管計數(shù)，計算出每1mm2面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。每組大鼠選取5個腦片進行統(tǒng)計分析。

1.8 凋亡細胞TUNEL染色 采用凋亡細胞DNA原位末端標記法(TUNEL)標記凋亡細胞。按神經(jīng)細胞及組織原位凋亡檢測試劑盒操作步驟進行染色，顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞的表達。選取缺血區(qū)額頂葉皮質(zhì)上部3個高倍視野，內(nèi)側(cè)尾狀核區(qū)2個高倍(×40)視野進行凋亡細胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評分 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后3d及7d，與Ad-GFP對照組比較，Ad-ANG治療組大鼠神經(jīng)功能缺失評分顯著降低(P＜0.05)，1d和14d時兩組間神經(jīng)功能缺失評分無顯著差別(見圖1)。

2.2 綠色熒光蛋白的表達 Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后1d、3d時，熒光顯微鏡下可見室管膜周圍及脈絡(luò)叢有較強的綠色熒光，強度顯著高于7d和14d(P＜0.05)，7d后兩組大鼠上述部位熒光較前減弱，14d時兩組大鼠均僅見脈絡(luò)叢有微弱的綠色熒光，Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組在各時間點的熒光強度無顯著差異。

2.3 HE染色結(jié)果 各組大鼠缺血腦區(qū)均有不同程度神經(jīng)細胞變性壞死，間質(zhì)水腫，膠質(zhì)細胞增生;部分呈點片狀，島狀梗死灶，范圍大小不等。與對照組相比，Ad-ANG治療組壞死區(qū)縮小，上述各種病理表現(xiàn)程度減輕。

2.4 ANG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ANG陽性細胞呈棕黃色。Ad-ANG治療組大鼠鏡下可見室管膜周及缺血皮層及皮層下大量ANG陽性細胞，側(cè)腦室注射后3d、7d時陽性細胞數(shù)高于14d(P＜0.05)。Ad-GFP對照組也有少量ANG細胞的表達，主要分布于缺血區(qū)大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下，各時間點陽性細胞數(shù)明顯低于Ad-ANG治療組(見圖2)。

2.5 缺血腦區(qū)微血管密度分析 vWF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，缺血腦區(qū)微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細胞圍成，部分血管無明顯管腔，內(nèi)皮細胞呈條索狀，有的只見單個或成簇的內(nèi)皮細胞。Ad-ANG治療組大鼠側(cè)腦室注射后3、7和14d時梗死周邊區(qū)可見較多散在的單個內(nèi)皮細胞，微血管數(shù)量明顯多于Ad-GFP對照組(P＜0.01)(見圖3)。

2.6 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL陽性細胞呈棕褐色，胞體縮小，可見核固縮和核破裂，主要分布在腦梗死灶及其周圍。在側(cè)腦室注射后3d、7d、14d，與Ad-GFP對照組相比，Ad-ANG治療組缺血腦組織凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目顯著減少(P＜0.05)(見圖4)。

圖1 Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組大鼠神經(jīng)功能缺失評分在腦缺血再灌時、側(cè)腦室注射時及注射后隨時間變化趨勢圖，與Ad-ANG組相比較*P＜0.05

圖2 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射重組ANG腺病毒后腦內(nèi)ANG陽性細胞計數(shù)情況，與Ad-GFP組比較#P＜0.01;與Ad-ANG治療1d組比較a P＜0.05;與Ad-ANG治療14d組比較b P＜0.05

圖3 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后不同時間點缺血皮層微血管密度(血管數(shù)/mm2)

圖4 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后不同時間點各組大鼠缺血腦區(qū)TUNEL陽性細胞計數(shù)

3 討論

腦缺血后梗死灶周圍血管通過新生血管供應(yīng)缺血組織有助于缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，補充外源性促血管生成因子有助于缺血腦區(qū)血管數(shù)目增加，減輕缺血性損害［10，11］。全身給予促血管生長因子的有益作用依賴于治療的時間點，腦缺血再灌注后1～3d給予促血管生長因子可促進神經(jīng)功能恢復(fù)［10］。

血管生長素ANG是一種單鏈蛋白質(zhì)，分子量為14.4kD，在血管生長過程中的多個環(huán)節(jié)均有作用［3］。在生理狀態(tài)下 ，ANG的表達受到嚴格的調(diào)控，缺氧及局部浸潤的巨噬細胞分泌TNF2α、IL-1β等因子能誘發(fā)ANG表達的增加，從而促進血管的生成［12］。我們既往研究［6］也發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后再灌注腦內(nèi)ANG的表達明顯增高，提示ANG可能參與腦缺血后腦組織的修復(fù)。外源性給予ANG能刺激缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)形成和增加局部血流，并且已在外周動脈閉塞性模型［4］及慢性心肌缺血模型［5］中成功應(yīng)用。

本實驗中大鼠于腦缺血再灌注24h后側(cè)腦室注射Ad-ANG，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在室管膜周圍以及脈絡(luò)叢表達，注射3d后表達最為強烈，14d時脈絡(luò)叢仍有微弱表達，并有逐漸向缺血腦區(qū)遷移的趨勢，提示側(cè)腦室注射重組病毒可以在腦損傷大鼠腦內(nèi)存活，轉(zhuǎn)染的Ad-ANG載體能夠在腦組織內(nèi)表達，并能向缺血腦區(qū)移行。染色顯示Ad-ANG治療組缺血腦區(qū)間質(zhì)的水腫和神經(jīng)元的受損有明顯減輕，大鼠室管膜周圍及缺血皮層及皮層下可見大量ANG陽性細胞，在注射后3d、7d、14d時大鼠缺血區(qū)微血管的密度顯著高于Ad-GFP對照組，提示側(cè)腦室內(nèi)注射Ad-ANG能在較長時間內(nèi)上調(diào)腦缺血大鼠腦內(nèi)ANG蛋白表達，促進新生血管的生成，在減輕腦缺血性損傷，對缺血再灌注損傷腦組織有保護作用。

細胞凋亡在腦缺血后腦神經(jīng)損害中起著重要作用。抑制缺血后細胞凋亡是減輕腦缺血損傷的重要手段。本研究觀察到，在側(cè)腦室注射Ad-ANG后3d、7d、14d時腦梗死灶周圍組織凋亡細胞數(shù)顯著減少，提示ANG對腦缺血的保護作用可能還通過減少神經(jīng)細胞缺血性凋亡而實現(xiàn)。

小結(jié):本研究結(jié)果提示重組腺病毒介導(dǎo)的血管生長素基因轉(zhuǎn)染可以促進腦缺血大鼠缺血腦區(qū)新生血管的生成，減輕腦水腫，減少凋亡細胞數(shù)目等，從而促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。

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