大理地區健康人陰道念珠菌體外藥物敏感性研究

何 偉，陳財發，姚 毅，朱 文，楊澤麗，白 麗*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理學院公共衛生學院，云南大理 671000）

念珠菌屬條件致病性酵母樣真菌，常寄生于人體與外界相通的腔道中，如口腔、腸道、陰道等，健康人群攜帶率較低（口腔中約9%）〔1〕。由各種原因（如HIV感染，抗生素的濫用等）導致機體抵抗力下降、菌群失調或寄生位置發生改變所致的真菌機會性感染呈日益增多的趨勢，其中主要是念珠菌病〔2-3〕。隨著抗真菌藥物在黏膜念珠菌病中的廣泛使用，念珠菌的敏感性逐漸降低，耐藥株呈現增加趨勢。抗真菌藥物敏感性的研究變得尤為重要。本文采用美國臨床和實驗室標準化研究所（The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的M27-A2方案，即微量液基稀釋法，通過對分離自大理地區健康女性陰道念珠菌的藥物敏感性的分析，為臨床抗真菌藥物的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 分離自大理健康人群陰道念珠菌45株。 經過鑒定〔4〕，包括29株光滑念珠菌（Candida glabrata），11株白色念珠菌 （ Candida albicans），4株克柔念珠菌（Candida krusei），1株熱帶念珠菌（ Candida tropicalis） 。

1.2 標準菌株 ATCC10029（大理學院病原生物學綜合實驗室保存）作為4種藥物的敏感性標準株。

1.3 RPMI-1640液的配制 取10.4 g RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，GIBCO）溶于900 mL無菌水中，加入34.53 g三氮嗎啡啉丙磺酸（MOPS，夏斯生物）至其終濃度為0.165 mol/L，室溫下用磁力攪拌器混勻2～3 h，使其充分溶解，用1 mol/L NaOH調pH至7.0（25℃），用滅菌雙蒸水定容至1 L，濾過除菌，備用。

1.4 抗真菌藥物

1.4.1 儲存液 儲存液的濃度為應用液10倍，5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine，5-FC）和氟康唑（Fluconazole，FCZ） 為1280 μg/mL， 兩性霉素B（ AmphotericinB，AMB） 和酮康唑（ Ketoconazole，KCZ） 為320 μg/mL，分裝于-70℃保存備用。4種藥物均來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.4.2 應用液的制備 用RPMI-1640液將儲存液作1∶10稀釋，FCZ和5-FC為128～0.25 μg/mL10個系列濃度，AMB和KCZ為32～0.06 μg/mL10個系列濃度，均為兩倍終濃度。

1.4.3 微量藥敏培養板的制備 使用96孔平底微量培養板，1～10列分別加入系列濃度梯度的抗真菌藥物的應用液，從高濃度到低濃度，11列及12列加入RPMI-1640液（作為生長對照及空白對照），每孔100 μL，放入-20℃冰箱備用，使用時需經4℃和室溫各1 h。

1.5 藥敏試驗

1.5.1 念珠菌的激活與稀釋 將待測菌株在YPD（ 1%yeast extract，1%peptone，2%dextrose） 瓊脂培養基上兩次激活后，用生理鹽水配制菌懸液，取少許，在血細胞計數板上計數，用RPMI-1640液調整濃度為3×103CFU/mL（ 2倍終濃度）。

1.5.2 加樣 在上述制備好的含抗真菌藥物的培養板上加入念珠菌懸液，每孔100 μL，空白對照不加，振蕩混勻后放入濕盒中，35℃孵育48 h后觀察結果。

1.5.3 結果判斷 肉眼判斷結果，以生長對照孔為依據，AMB為完全抑制即MIC 100作為觀察終點，液體清亮；其余3種藥以80%抑制作為觀察終點，即MIC 80為觀察終點，菌體生長明顯減少，液體輕微渾濁；同時陽性生長對照孔中生長良好，空白對照清亮，無菌生長，質控菌株MIC值在CLSI推薦的M27-A2方案規定的范圍內，才能判斷實驗的有效性。質控菌株對抗真菌藥物的MIC值符合CLSI推薦的M27-A2方案關于質控菌株標準的要求〔5〕。

1.6 四種常用抗真菌藥物敏感性判斷標準 根據菌株的MIC值范圍，參照文獻〔1，6〕，判斷念珠菌的敏感程度，分為敏感（susceptible，S）、劑量依賴性敏感（ susceptible dose-dependent，SDD）、和耐藥（ resistant，R） 3種。 見表1。

表1 抗真菌藥物敏感性判斷標準（MIC）（μg/mL）

2 實驗結果

2.1 陰道念珠菌分離株對四種藥物敏感性 45株健康人群陰道念珠菌對抗真菌藥物FCZ、KCZ、5-FC、AMB的耐藥率分別為：8.89%、6.67%、6.67%、2.22%，敏感率分別為：80%、84.44%、91.11%、97.78%，見表2。

表2 45株陰道念珠菌對四種抗真菌劑的藥物敏感性n（%）

比較4種抗真菌藥物的耐藥率，經卡方檢驗χ2=1.829，P=0.609，4種藥物的耐藥率差異無統計學意義。比較4種抗真菌藥物的敏感率，經卡方檢驗χ2=7.881，P=0.049，4種藥物的敏感率差異有統計學意義；經秩和兩兩檢驗，45株念珠菌對4種抗真菌藥物的敏感率除AMB的藥物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的藥物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余藥物的敏感率差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 交叉耐藥情況及其MIC值 結果顯示1株克柔念珠菌（425） 同時對FCZ、KCZ和5-FC三種藥物耐藥，另一株克柔念珠菌（460）對KCZ和5-FC同時耐藥，說明存在交叉耐藥現象，且都是克柔念珠菌。見表3。

表3 8株耐藥念珠菌對抗真菌藥物的MIC值（ μg/mL）

3 討論

近年來，念珠菌的感染率逐漸升高，臨床選擇敏感的抗真菌藥物治療感染顯得越來越重要〔7〕。本研究調查了分離自大理地區健康女性陰道45株念珠菌對臨床常用的四種抗真菌劑的敏感性，結果顯示分離株對AMB的藥物敏感率最高（97.78%），FCZ的藥物敏感率最低（80%）；藥物敏感率除AMB的藥物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的藥物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余藥物的敏感率差異無統計學意義（ P＞0.05），這與郭利軍〔8〕等報道的AMB敏感性最好相符。藥物的耐藥率差異無顯著性，與之前近年國內周訊〔9〕等報道比較的相比，念珠菌對FCZ、KCZ和5-FC耐藥率相似，對AMB耐藥率相差較大，這可能與近年來臨床上和個人常用抗真菌藥物為唑類有關。提示今后念珠菌的感染在用藥上應注意聯合用藥，在唑類藥物效果不明顯時考慮應用兩性霉素。45株念珠菌中有2株同時耐受多種抗真菌藥物，且都為克柔念珠菌，此交叉耐藥現象與Rex〔10〕等報道的相似，這提示臨床用藥要注意耐藥株的存在，特別是具有交叉耐藥性的克柔念珠菌。綜上所述，4種臨床常用抗真菌藥物均可選作陰道念珠菌病的治療，但相比而言，更推薦使用AMB，同時應注意某些菌株的劑量依賴性敏感、耐藥及交叉耐藥現象，尤其是克柔念珠菌。

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〔5〕National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts.Approved standard，2nd ed.M27-A2.Wayne， Pa： National Committee for Clinical Laboratory Standards〔S〕.2002.

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〔10〕Rex JH，Rinaldi MG，Pfaller MA，et al.Resistance of Candida Species to fluconazole〔J〕.Antimicrob Agents Chemother， 1995，39（ 1） ：1-8.