不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌對(duì)寄主幼蟲(chóng)侵染力研究*

涂永勤，朱華李，張德利，陳仕江

（重慶市中藥研究院，重慶 400065）

冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，又名蟲(chóng)草，系麥角菌科蟲(chóng)草屬真菌中國(guó)被毛孢寄生蝠蛾屬昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體，是我國(guó)特有珍稀名貴中藥材。具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、陽(yáng)痿遺精、病后體虛、老年慢性咳嗽等疾病[1]。冬蟲(chóng)夏草主產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、云南、四川和甘肅等省區(qū)海拔3 500 m~5 200 m局部高寒山區(qū)草甸地帶，天然資源十分有限。近年來(lái)，由于價(jià)格上漲，過(guò)度采挖，加之生態(tài)環(huán)境的惡化，天然資源日趨枯竭。因此，人工栽培冬蟲(chóng)夏草勢(shì)在必行。冬蟲(chóng)夏草菌能否感染寄主昆蟲(chóng)是冬蟲(chóng)夏草人工培殖的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)之一。有關(guān)冬蟲(chóng)夏草侵染寄主幼蟲(chóng)的技術(shù)雖然已有大量的研究[2-6]，但感染率普遍較低，除接種方法外，與不同菌株的侵染力有一定關(guān)系。本試驗(yàn)研究不同菌株對(duì)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)感染能力的一些基本規(guī)律進(jìn)行探索。在此方面，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有研究報(bào)道?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蟲(chóng)種

小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis Tu et Ma，采自四川阿壩藏族羌族自治州小金縣崇德鄉(xiāng)崇德牧場(chǎng)；貢嘎蝠蛾H.gonggaensis Fu et Huang，采自四川甘孜藏族自治州康定縣老榆林鄉(xiāng)雅家?。槐热珧鸲闔.biruensis Fu.Sp.nov，采自西藏那曲地區(qū)比如縣恰則鄉(xiāng)；劍川蝠蛾H.jianchuanensis Yang，引自云南省劍川縣老君山；石渠蝠蛾H.sp.采自四川省甘孜藏族自治州石渠縣德榮瑪鄉(xiāng)。

1.1.2 菌種

采自全國(guó)主要冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)區(qū)，即四川理塘、雅江、石渠、白玉、康定沙德、康定雅家埂、青海玉樹(shù)、雜多縣、西藏比如、丁青、云南德欽縣白馬雪山、劍川縣老君山等地的天然冬蟲(chóng)夏草，經(jīng)分離純化、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化為具有侵染能力的菌體形態(tài)（分生孢子）備用。

1.1.3 試驗(yàn)儀器、器具和試劑

BH2P Olympus生物研究顯微鏡，日本產(chǎn)；JSZ6S型體視鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司生產(chǎn)；LRH-250型光照恒溫箱，上海產(chǎn)躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海產(chǎn)躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；養(yǎng)蟲(chóng)盒、基質(zhì)、飼料植物珠芽蓼、酒精及“84”消毒液等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌感染寄主昆蟲(chóng)試驗(yàn)

將不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌株經(jīng)分離純化、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化而得的孢子懸浮液，進(jìn)行接菌感染試驗(yàn)。每處理用30頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次。于接菌6個(gè)月后，挑取幼蟲(chóng)血淋巴，在顯微鏡下，觀察幼蟲(chóng)感菌情況。

1.2.2 冬蟲(chóng)夏草菌感染不同寄主幼蟲(chóng)試驗(yàn)

選用全國(guó)主要冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)區(qū)寄主昆蟲(chóng)5個(gè)種進(jìn)行感染試驗(yàn)，每處理30頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次。于接種6個(gè)月左右時(shí)間，顯微鏡檢查幼蟲(chóng)感染情況。

1.2.3 不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草差異比較

觀察不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草子座、子囊殼及子囊孢子形態(tài)及色澤的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄主幼蟲(chóng)感染的檢查

接種幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)6個(gè)月左右后，挑去幼蟲(chóng)血淋巴，用顯微鏡檢查幼蟲(chóng)感染情況。結(jié)果表明,在顯微鏡下，感染幼蟲(chóng)血淋巴內(nèi)可以見(jiàn)到大量密集、形態(tài)相似、長(zhǎng)寬相近的菌絲段或分生孢子（圖1、圖2）。這些菌體，經(jīng)交結(jié)成菌核，萌發(fā)產(chǎn)生子座（Stroma），并最終形成冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis） 藥材[7]。

圖1 冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子（高倍）

圖2 冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子（低倍）

2.2 不同菌株感染寄主幼蟲(chóng)

用冬蟲(chóng)夏草菌的不同菌株對(duì)寄主幼蟲(chóng)（小金蝠蛾）接種，感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，除老君山蟲(chóng)草菌不能侵染寄主幼蟲(chóng)外，其他菌株都能不同程度地侵染小金蝠蛾，但侵染力有差異。小金蟲(chóng)草菌菌株最高感染率為72.22%，西藏比如蟲(chóng)草菌株感染率最低為45.56%。

2.3 不同寄主蝠蛾幼蟲(chóng)感染冬蟲(chóng)夏草菌

表1 不同菌株感染寄主幼蟲(chóng)情況

不同種類(lèi)寄主蝠蛾幼蟲(chóng)感染冬蟲(chóng)夏草菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同寄主昆蟲(chóng)感染情況

從表2可以看出，冬蟲(chóng)夏草菌（康定沙德菌株）除不能侵染劍川蝠蛾外，對(duì)其他蟲(chóng)草蝠蛾均能侵染。但對(duì)不同種寄主幼蟲(chóng)的侵染力有差異。貢嘎蝠蛾感染率最高為75.56%，比如蝠蛾感染率最低為58.89%。劍川蝠蛾不能感染冬蟲(chóng)夏草菌，而老君山蟲(chóng)草菌亦不能侵染其他蟲(chóng)草蝠蛾，說(shuō)明兩者可能為不同的種，這也證明了陳吉岳等[8]的研究。

2.4 冬蟲(chóng)夏草菌菌株間的比較

冬蟲(chóng)夏草菌菌株內(nèi)或菌株間子實(shí)體在色澤上有一定的變化，由灰（枯）黃色、深褐色到黑色的變化，老君山蟲(chóng)草無(wú)色澤變化，為棕黃色或棕色。冬蟲(chóng)夏草各菌株多生長(zhǎng)在高山草甸土中，而老君山蟲(chóng)草多在林下與苔蘚混生。老君山蟲(chóng)草的子座纖細(xì)很長(zhǎng)，棕色，產(chǎn)孢部分短，子囊殼較大，排列不規(guī)則（圖3）；而冬蟲(chóng)夏草的子座一般較短且粗，呈長(zhǎng)圓錐體狀，產(chǎn)孢部分比較長(zhǎng)，差不多占到了子座的一大半，子囊殼較小，排列緊密規(guī)則（圖4）。在顯微鏡下，老君山蟲(chóng)草的子囊孢子細(xì)長(zhǎng)（圖5），冬蟲(chóng)夏草菌的子囊孢子相對(duì)較粗短（圖6）。不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌在子囊孢子形態(tài)上沒(méi)有差別。

3 討論與結(jié)論

圖3 老君山蟲(chóng)草子座及產(chǎn)孢器

圖4 冬蟲(chóng)夏草子座及產(chǎn)孢器

圖5 老君山蟲(chóng)草子囊孢子

圖6 冬蟲(chóng)夏草子囊孢子

寄主幼蟲(chóng)感染冬蟲(chóng)夏草菌是冬蟲(chóng)夏草人工培殖的關(guān)鍵技術(shù)之一?，F(xiàn)有研究表明中國(guó)被毛孢[9,10]是冬蟲(chóng)夏草菌的無(wú)性型。目前，冬蟲(chóng)夏草菌侵染寄主蝠蛾的機(jī)理尚不清楚。有人從冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中分離無(wú)性型時(shí)，除分離出中國(guó)被毛孢 （Cordyceps sinensis） 外，還分離到中國(guó)擬青霉（Paecilomyces sinensis Chert,Xiao＆Shi）、中國(guó)金孢霉（Chrysosporium sinense Liang） 和蟲(chóng)生簇孢 （Sporothrix insectorumde Hong＆Evans）等多種真菌。用分子生物學(xué)方法證明，在子座成熟過(guò)程中，中國(guó)被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉有DNA共存和競(jìng)爭(zhēng)增殖[11-13]。所以，認(rèn)為冬蟲(chóng)夏草菌侵染寄主幼蟲(chóng)是冬蟲(chóng)夏草菌與蝙蝠蛾擬青霉等菌的復(fù)合侵染。但是，本研究用經(jīng)純化的冬蟲(chóng)夏草菌孢子液為菌種，且基質(zhì)、飼料都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒處理，冬蟲(chóng)夏草菌仍然能使蝠蛾幼蟲(chóng)感染成功，獲得了冬蟲(chóng)夏草藥材。重要的是在人工飼養(yǎng)蝠蛾幼蟲(chóng)中，蝠蛾幼蟲(chóng)一旦被蝙蝠蛾擬青霉菌侵染，無(wú)論蟲(chóng)體打小，幼蟲(chóng)最早10 d左右死亡，最晚在1個(gè)月內(nèi)全部死亡，死亡蟲(chóng)體內(nèi)被擬青霉菌所充滿(mǎn)，大量孢梗束伸出，頂端產(chǎn)生大量近球形的分生孢子。如果侵染有擬青霉菌參與，就不大可能長(zhǎng)成冬蟲(chóng)夏草藥材。由此證明冬蟲(chóng)夏草菌侵染寄主幼蟲(chóng)，應(yīng)該是由冬蟲(chóng)夏草菌單一侵染的結(jié)果，而非與其他菌的復(fù)合侵染。有關(guān)冬蟲(chóng)夏草菌侵染寄主幼蟲(chóng)的過(guò)程及機(jī)理有待深入研究。

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