植物黃芪根內生真菌的分離1)

馬 偉 賈艷姝 李 娜 龔 賀 張艷賀

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］為名貴中藥材。但目前對其過度的采挖，已造成傳統道地黃芪已遠遠不能滿足市場需求［1－2］。因此從天然藥用微生物的角度出發，分離有價值的黃芪內生真菌對保護野生資源具有重要意義［3－7］。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

試驗儀器:FA2004型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);DZKW－C型儀表恒溫不銹鋼水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司);手提式壓力鍋(上海申安醫療器械廠);CLASSⅡTYPE B2潔凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司);HZQF160震蕩培養箱(中國哈爾濱市東聯電子科技開發有限公司);隔水式恒溫培養箱(上海－恒科技有限公司);Nikon－80i顯微鏡(JAPAN);平板培養皿、三角瓶(上海五一玻璃儀器廠)。

試驗試藥:牛肉膏、酵母提取物、胰化蛋白胨、蛋白胨、可溶性淀粉(北京奧博星生物技術有限責任公司);瓊脂(JAPAN.OXOID ENGLAND);葡萄糖(分析純，天津基準化學試劑有限公司);醫用酒精(齊齊哈爾市鶴城消毒劑廠)。

植物材料為蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］的健康植株，采集時間為2009年10月，采集地點為黑龍江省農科院園藝分院黑龍江中醫藥大學黃芪試驗田。

1.2 方法

1.2.1 試劑的制備

PDA(A)——PDA粉末與蒸餾水配制而成;牛肉膏蛋白胨固體培養基(B)——牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCI 5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH=7.4 ～7.6;LB(Luria－Bertani)固體培養基(C)——胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g;高氏 I號培養基(D)——可溶性淀粉 20 g，KNO 31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，pH=7.4 ～7.6。

1.2.2 內生真菌的分離純化及培養基的篩選

組織培養:選擇無病斑新鮮黃芪根塊沖洗干凈，晾至表面無水珠，取主根切成約3 cm長的小段，注意保持切口的整齊。

培養組織表面消毒:自來水沖洗干凈，75%乙醇漂洗3 min，無菌水沖洗3次，10%的次氯酸鈉溶液浸泡7 min，無菌水沖洗3次，每次2 min。為檢查材料表面消毒是否徹底做對照實驗如下:①接組織塊:將與上述同樣條件處理過的根段不作分割，直接種植在4種培養基平皿上，置于相同條件下培養;②接洗滌水:將最后一次清洗消毒組織塊的無菌水0.1 mL涂于4種培養基表面，置于相同條件下培養，③直接印跡:將與上述同樣條件處理過的根段直接在4種培養基表面做印跡。

培養基的選擇:將上述處理過的根段在無菌條件下切去兩端，剩余部分分割成小片，隨機將小片分別種植于4種培養基平板上，每種培養基設3個平行皿，每皿4片，置于30℃恒溫培養箱中培養3～7 d，并以4種空白培養基做對照。空白對照做3種處理，一是不做任何處理;二是將培養基內接入消毒時要使用的同等條件下滅菌的無菌水少許;三是在消毒操作過程中，將倒入培養基的培養皿開蓋暴露于超凈臺內，目的是為了驗證培養基、無菌水和超凈臺滅菌是否徹底。

分離菌的培養:觀察實驗培養皿及對照皿情況，隨時觀察出菌情況及組織片變化，待根組織邊緣長出菌后，挑取菌絲或菌體，經平板劃線法和平板稀釋法反復分離、純化，培養觀察菌落的形態，比較4種培養基對黃芪內生真菌的分離情況，并對菌落的生長及特征做相應的記錄。將所得菌株編號，轉入相應斜面培養基培養16 h，放入4℃冰箱短期保藏，備用。

1.2.3 內生真菌的形態學鑒定

采用濕室法制備標本片:對培養皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、蒸餾水、PDA培養基等試劑和器皿進行消毒滅菌處理，在培養皿中放入兩片蓋玻片(距離約為10 mm)，并放入無菌水適量，備用。在固體培養基尚未凝固前，用蓋玻片沾取培養基，使其表面形成一層薄的培養基;并將蓋玻片置于培養皿中的蓋玻片上，形成橋狀。挑取少量待測菌株菌絲，接種于蓋玻片上，培養2～3 d，將蓋玻片轉移到滅菌的載玻片上鏡檢觀察并拍攝顯微圖像。根據菌株的培養性狀和顯微圖像，結合真菌分類鑒定相關文獻進行初步分類。

2 結果與分析

2.1 表面消毒效果

實驗確定了黃芪根塊的最佳表面消毒方式，即先在75%乙醇中漂洗3 min，后用10%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒7 min，空白對照應選擇印跡法或接洗滌水法。在上述表面消毒操作中，所有空白培養基及印跡法和接洗滌水法在整個觀察過程中均未染菌;而接組織塊法中，在第5天后，組織塊兩端有時會有菌長出。

2.2 培養基的選擇

在上述分離純化操作中，在PDA培養基中得到內生真菌19株，LB(Luria－Bertani)固體培養基中得到內生真菌6株，高氏I號培養基中得到內生真菌1株，牛肉膏蛋白胨固體培養基中得到內生真菌2株;菌株在PDA培養基中長勢最好，且分離得到的內生真菌數量最多(表1)。用4種不同的培養基進行黃芪內生真菌的分離時，PDA培養基無論是在提取菌的數量上，還是在菌的生長狀態上都要明顯好于其他3種培養基。因此，確定PDA培養基為本實驗最佳的提取分離黃芪內生真菌的培養基。

表1 各菌株在各自提取培養基上培養96 h時的菌落形態特征

3 結論與討論

本研究共從黃芪根塊中共分離出28株內生真菌，采用形態學鑒定和分子生物學鑒定相結合的方式，對所有的內生真菌進行了分類鑒定。結果在28株黃芪內生菌中，鐮孢菌屬19株，生赤殼屬3株，裸胞殼屬2株，枝穂霉屬、枝頂孢屬、青霉屬及曲霉屬各1株。

在材料表面消毒過程中，用同樣操作方法對材料表面消毒后，采取3種不同的方法驗證表面消毒效果。結果發現，印跡法和接洗滌水法在整個培養過程中均未染菌，而接組織塊法中，在第5天后，組織塊兩端有時會有菌長出。如果其他操作不變，將次氯酸鈉消毒時間延長至10 min時，)組織塊兩端依然會有不同程度染菌。因此，這不能表明表面消毒不徹底。接組織塊在第5天后兩端染菌，原因可能是表面消毒過程中，消毒液使組織塊失活或部分失活，加之材料經過了連續5 d 28℃的培養，導致組織塊內部水分或其他液體從組織塊兩端滲出，材料中的內生菌也隨之外滲，使組織塊兩端染菌。因此，在提取內生菌的研究中，根據材料的不同，采用合理的表面消毒效果驗證方法，對于保證內生菌提取的數量和質量具有重要意義。本試驗研究表明，驗證蒙古黃芪根塊表面消毒效果采用印跡法和接洗滌水法效果較好。

在內生真菌的形態學鑒定過程中，采用濕室法制片后，鏡下觀察時沒有加蓋蓋玻片，有效地保護了菌絲和孢子的形態結構，取得良好的觀察效果。

［1］陳聰穎，陸陽，陳澤乃.內蒙黃芪的研究概況［J］.中草藥，2001，32(6):567－569.

［2］侯娜菲.黃芪的藥用價值［J］.時珍國藥研究，1996，7(5):316.

［3］谷蘇，邵華，蔣曉華，等.藥用植物內生真菌多樣性及其活性成分的潛在應用價值［J］.中國藥學雜志，2001，36(1):14－15.

［4］何勁，劉蘊哲，康冀川，等.植物內生菌及其在農業和醫學上的用途［J］.貴州農業科學.2006，34(3):113－115.

［5］郭良棟.內生真菌研究進展［J］.菌物系統，2001，20(1):148－152.

［6］顧謙群，溫江妮，朱天驕，等.藥用植物內生真菌——天然活性產物新資源［J］.中國海洋大學學報，2006，36(3):365－369.

［7］鄒文欣，譚仁祥.植物內生菌的研究新進展［J］.植物學報，2001，43(9):881－892.