1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在線聯用分析

張 萍，王仲孚，黃琳娟

（1.咸陽師范學院化學與化工學院，陜西 咸陽 712000；2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在線聯用分析

張 萍1，2，王仲孚2，黃琳娟2

（1.咸陽師范學院化學與化工學院，陜西 咸陽 712000；2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

為了給寡糖質量控制和分析研究提供方法參考，對1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）衍生化試劑在液相色譜（HPLC）和電噴霧質譜（ESI－MS）技術分析寡糖中的應用進行研究。用PPMP試劑在氨水介質中對葡寡糖鏈進行衍生化，衍生化產物用RP－HPLC分離，ESI－MS分析。實驗表明：在確定的衍生化條件下，PPMP和寡糖的衍生化主產物為單分子標記物，葡寡糖混合物的單分子PPMP衍生物在ESI－MS的正負離子模式下均有較好的響應，并且在RP－HPLC柱上能夠實現很好地分離。據此建立了PPMP柱前衍生，HPLC－ESI／MS在線聯用分析寡糖混合物組成的方法。該方法定性準確、樣品處理簡單、分析速度快、結果準確可靠，可作為寡糖樣品的質量控制、構效關系研究等方面的一種測試方法。

高效液相色譜；電噴霧電離質譜；1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮；衍生化；寡糖

寡糖（oligosaccharide）又稱寡聚糖或低聚糖，一般是由2至10個單糖縮合而成的聚合物［1－3］。近年來隨著分子生物學、醫學、生物化學等前沿交叉學科的發展，人們對寡糖構效關系的認識逐漸提高，寡糖成為近年來研究的熱點。研究表明許多寡糖具有低熱、穩定、安全無毒、無殘留等理化性質，能夠抑制細菌、提高機體免疫能力、降低血清膽固醇、抗病毒和抑制腫瘤細胞［1－7］，在疾病診斷與預防、營養與保健、畜牧養殖、植物生長調節及抗病毒等方面有巨大的應用潛力［8］。由于糖類化合物本身水溶性強、極性較高、成分復雜、無明顯的光學吸收，使其分析檢測存在很大的困難。到目前為止，用于寡糖分析的方法有薄層色譜法（TLC）、毛細管電泳法（CE）、糖電泳法、高效液相色譜法（HPLC）以及質譜法［9－14］。其 中 HPLC、生 物 質 譜 （MS）以 及HPLC－MS聯用技術是目前分析寡糖強有力的工具［13－16］。對寡糖進行衍生化可以改善寡糖的疏水性、光學吸收和質譜檢測的離子化效率，增強 HPLC和 MS分析的靈敏度［17－19］。

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）是本研究組合成的一種1，3－取代吡唑啉酮類試劑，是傳統糖類衍生試劑PMP（1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮）的類似物。本實驗在實現PPMP柱前衍生－HPLC－ESI／MS分析單糖混合物［20］的基礎上，以葡寡糖為實驗對象，將PPMP衍生化擴展到對寡糖的柱前衍生 HPLC－ESI／MS分析的研究上，以期為寡糖的分析提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Thermo LTQ XL型高效液相色譜－質譜聯用儀：美國Thermo公司產品，配有Finnigan Surveyor PDA檢測器、自動進樣器以及四元梯度泵、電噴霧電離源（ESI）、離子阱質量分析器。

1.2 主要材料與試劑

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮：自制，HPLC測定純度大于99.2%；葡寡糖混合物，又名麥芽糊精（maltodextrin）：美國Sigma公司產品；乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司產品；二氯甲烷、氨水、乙酸銨等：均為分析純，天津第三化學試劑廠產品。

1.3 實驗條件

1.3.1 HPLC 條件 采用 Symmetry Shield RP18（4.5m×250mm，5μm）色譜柱；流動相：0.01mol／L NH4Ac溶液（pH 4.5）和乙腈的混合溶液；梯度洗脫；柱溫37℃；流速800μL／min；UV檢測波長為245nm；進樣量10μL。

1.3.2 質譜（ESI－MS）條件 鞘氣流速12L／min；輔助氣1.5L／min；毛細管溫度375℃；正離子模式下，噴霧電壓5kV，毛細管電壓48V，透鏡電壓80V；負離子模式下，噴霧電壓5kV，毛細管電壓－48V，透鏡電壓－120V；HPLC、ESI－MS聯用時，流動相在流經UV檢測器后采用分流比1∶4進入MS分析。

1.4 標記衍生化

準確稱取1.0mg的葡寡糖maltodextrin于5mL反應瓶中，用100μL Mill－Q水充分溶解，加入100μL 0.1mol／L的PPMP甲醇溶液和50μL的氨水，渦旋混勻后，在80℃水浴反應70 min，N2吹干，加1.0mL Mill－Q 水和1.0mL CH2Cl2充分溶解并震蕩、離心，棄去下層CH2Cl2相，同法用CH2Cl2萃取水相3次，以去除過量的PPMP試劑，水相即為PPMP衍生化的maltodextrin混合物試液。以13 000r／min高速離心后，取兩等份，分別用于ESI－MS及HPLC聯用分析。

2 結果與討論

2.1 衍生化產物的結構

由于1，3取代的吡唑啉酮試劑的吡唑酮環上C4位存在α氫，在堿性環境下離去成為烯醇式負離子，和糖類物質的還原端進行醛酮之間的縮合反應，在加熱條件下失水成為具有α，β不飽和酮結構的單分子衍生物。此單分子衍生物會繼續與另一分子吡唑啉酮試劑的烯醇式負離子進行Michael 1，4加成反應，從而也可能使糖類物質標記上2分子吡唑啉酮試劑。反應式示于圖1。

圖1 PPMP與還原性寡糖的衍生化反應原理Fig.1 Derivatization reaction mechanism of oligosaccharides with PPMP

由于Michael 1，4加成是一個受溫度控制的可逆反應，產物可能有單分子PPMP和雙分子PPMP兩種衍生產物，實際中控制合適的反應條件，可使反應向主產物方向進行。由于單分子PPMP衍生物比雙分子PPMP衍生物具有較好的穩定性，本研究組已經探索出單糖與PPMP生成單分子衍生物的條件［20］，即還原單糖與PPMP的物質的量之比為1∶6～1∶7，反應溫度80℃，反應時間70min。在此條件下，按照1.4衍生化步驟，對葡寡糖進行PPMP衍生化，產物經ESI－MS檢測，證實了該條件下衍生化主產物仍為單分子PPMP標記物。

2.2 寡糖混合物的HPLC－ESI／MS分析方法的建立

2.2.1 PPMP標記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的ESI－MS分析 取少量PPMP衍生化的葡寡糖混合物，用水稀釋10倍后，通過蠕動泵進ESI－MS分析，以PPMP標記的聚合度（Dp）為1的葡寡糖衍生物的分子離子峰［Glc＋PPMP＋H］＋m／z379.0為基準，對MS儀正離子檢測模式下的參數進行自動調諧和優化，得出ESI－MS正離子檢測PPMP－葡寡糖衍生物的最優條件為：鞘氣流速12L／min，輔助氣流速1.5L／min，噴霧電壓5kV，毛細管溫度300℃，毛細管電壓48V，透鏡電壓80V。同樣，以PPMP標記的聚合度（Dp）為1的葡寡糖衍生物的分子離子峰［Glc＋PPMP－H］－的 m／z 376.8為基準，對MS儀負離子檢測模式下的參數進行自動調諧和優化，得出ESI－MS負離子檢測PPMP－葡寡糖衍生物的最優條件為：鞘氣流速12L／min，輔助氣流速1.5L／min，噴霧電壓5kV，毛細管溫度375℃，毛細管電壓－48V，透鏡電壓－120 V。此條件下測得的PPMP衍生的葡寡糖混合物在正、負離子檢測模式下的MS圖示于圖2。由圖2可見，在PPMP衍生的葡寡糖混合物的MS圖上均檢出了17個分子質量相差162Da（1個葡萄糖殘基）豐度明顯的峰。在正離子模式檢測圖上依次歸屬為單分子PPMP衍生的聚合度（Dp）為1～17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP＋H］＋峰，在負離子模式檢測圖上依次歸屬為單分子PPMP標記的Dp1～Dp17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP－H］－峰。說明在單糖的衍生化條件下，PPMP和寡糖也可以實現衍生化，衍生化產物仍為單分子衍生物。圖中相對分子質量為2 000以后的糖鏈MS信號變弱，一方面可能是由于聚合度較大的寡糖含量較低；另一方面是由于本實驗使用的質譜儀在m／z 2 000以后的高質量端本身靈敏度較低。由圖2還可以看出，同一聚合度寡糖的正負離子模式檢測到的質譜峰能夠一一對應，吻合較好，說明單分子PPMP衍生的寡糖在ESI－MS的正負離子檢測模式下均有很好的響應，兼顧兩者能夠實現對寡糖的準確分析。據此說明PPMP衍生化可以用于寡糖樣品的衍生和質譜分析。

圖2 PPMP標記的maltodextrin混合物的ESI－MS圖Fig.2 ESI－MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.2 PPMP標記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC分離 為了證實單分子PPMP衍生的寡糖在反相色譜柱上的保留能力，本研究選用Symmetry Shield RP18（4.5m× 250mm，5μm）色譜柱，對PPMP標記的葡寡糖樣品進行HPLC分離，梯度洗脫程序為：10%ACN （0 min）～20%ACN （60min）～50%ACN （70 min）～50%ACN （130min）＋10mmol／L NH4Ac溶液 （pH 4.5），在優化的色譜條件下得到的色譜圖示于圖3。由圖3可見，PPMP衍生的寡糖混合物被分離為前后兩組區域的峰，即0～40min內出現的I區峰和80～120min內出現的II區峰。未去除干凈的PPMP在兩個區域中間出峰。根據衍生原理可推測，I區峰組為單分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖只標記了1分子PPMP，衍生物的極性相對于雙分子衍生物來說偏大，反相色譜保留能力相對較弱，優先出峰；而II區峰組為雙分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖標記了2分子PPMP，衍生物的極性較小，反相保留能力較強，因而較晚出峰。由于雙分子PPMP衍生物比單分子衍生物具有高出1倍的UV響應值，盡管有少量存在，也會表現出明顯的色譜信號峰。但就本實驗來說，這些雙分子衍生副產物與單分子衍生主產物在保留時間上相差40min，不會影響主產物的分析。由圖3還可看出，I區峰組比II區峰組有較好的分離度，說明單分子PPMP衍生物比雙分子PPMP衍生物更適于反相色譜模式的分離。

圖3 PPMP標記的maltodextrin混合物的RP－HPLC圖Fig.3 RP－HPLC chromatogram of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.3 PPMP標記的葡寡糖衍生物的HPLCESI／MS在線聯用分析 為了對PPMP－葡寡糖衍生物做進一步確認分析，本研究利用1.2色譜分離條件，結合2.2.1的正離子模式檢測的質譜條件，設定流動相在流經UV檢測器后采用分流比1∶4進入ESI－MS分析，實現對PPMP－葡寡糖衍生物的 HPLC－ESI／MS在線聯用分析。對I區峰組分析的HPLC－ESI／MS聯用檢測圖示于圖4。由圖4可見，HPLC上檢測出的17個色譜峰，被ESI－MS依次在線檢測為聚合度為Dp1～Dp17葡寡糖的單分子PPMP衍生物的分子離子［M＋H］＋、［M＋Na］＋或［M＋K］＋峰，這與2.2.1中衍生物直接進ESI－MS單獨分析的結果一致。證明單分子PPMP－葡寡糖衍生物能夠很好地實現HPLC和MS的在線聯用分析。對II區峰組分析也得到了類似的Dp1～Dp17的雙分子PPMP－葡聚糖衍生物的分子離子峰，如 m／z 617（Dp1）、m／z 779（Dp2）、m／z 941（Dp3）等 ［M＋Na］＋峰，因其 MS圖信號微弱，此處省略MS圖。

據此，本工作建立的PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在線聯用分析葡寡糖混合物組成的方法可以為寡糖的分析提供參考。

3 結 論

在反應溫度80℃，反應時間70min，PPMP過量6～7倍、氨水作為堿性介質的條件下，PPMP和葡寡糖的衍生化主產物為單分子衍生物。此單分子PPMP衍生物在ESI－MS的正負離子模式下均有較好的響應，并且混合物在RPHPLC柱上能實現很好地分離。據此，建立了PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在線聯用定性分析葡寡糖混合物組成的方法，該法兼顧了HPLC的高效分離和MS的高靈敏度、定性準確的優點，具有樣品處理簡單、分析速度快、分析結果準確可靠等優點，可作為寡糖樣品在質量控制、構效關系研究等方面的方法參考。

圖4 PPMP標記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC－ESI／MS圖（均為正離子模式檢測）Fig.4 HPLC－ESI／MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

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Analysis of Oligosaccharides Labeled with 1－（4－Isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone Using HPLC Coupled with On－line ESI－MS Techniques

ZHANG Ping，WANG Zhong－fu，HUANG Lin－juan
（1.Chemistry and Chemical Engineering School，Xianyang Normal University，Xianyang712000，China；2.The College of Life Sciences，Northwest University，Xi’an710069，China）

Maltodextrin was derivatized with 1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone（PPMP）in aqueous ammonia and derivatization products were analyzed by RP－HPLC separation and ESI－MS identification.The results indicated that mono－PPMP derivatives are still principal product for oligosaccharides.The mono－PPMP－derivatives for oligosaccharides from maltodextrins show satisfactory response to ESI－MS both in positive－ion mode and in negative－ion mode.The mixture of oligosaccharides derivatives with degree of polymerization 1—17was successfully separated by RP－HPLC.A new method for detecting thecomposition of oligosaccharides mixture with PPMP pre－column derivatization by HPLC coupled with on－line ESI－MS techniques was established.The method shows following merits：simple treatment for sample，fast analysis and accurate qualitation，and it can be used as a reference method for research of oligosaccharides’quality control and structure function relationship.

high performance liquid chromatography（HPLC）；electrospray ionization mass spectrometry（ESI－MS）；1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone （PPMP）；derivatization；oligosaccharide

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0225－07

2012－04－05；

2012－05－30

國家自然科學基金（31170773）、陜西省科技廳自然科學基金（2012JQ2014）、陜西省教育廳自然科學基金（2010JK894）、咸陽師范學院科研基金（11XSYK103）資助

張 萍（1977～），女（漢），陜西華縣人，講師，博士，主要研究方向為糖生物學與糖化學。Email：zhp4190＠163.com

黃琳娟（1969～），女（漢），教授，博士生導師，主要研究方向為糖生物學與糖化學。E－mail：huanglj＠nwu.edu.cn