亞側耳RAPD反應體系的優化

張躍新，閆寶松，馬鳳，胡偉

（黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江157011）

亞側耳（Hohenbuehelia serotina）［1－2］商品名元蘑，又名凍蘑，是黑龍江省特有的山珍之一。亞側耳肉質細膩，柔嫩鮮美，營養價值極高，含有人體所需的多種氨基酸、維生素和微量元素，經常食用具有加強肌體免疫，增強機體抵抗能力，益智開心，益氣不饑，延年輕身等作用。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）技術，是Williams和Welsh等1990年發明的一種新型DNA分子標記技術，該技術具有簡單、快速、準確、靈敏度高和多態性豐富等優點，廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因定位和遺傳多樣性的檢測［3］。本文在參考一般食用菌RAPD試驗的基礎上［4－5］，建立了亞側耳 RAPD基本反應體系，并對基本反應體系進行了優化，為亞側耳種質資源遺傳多樣性的RAPD分析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

亞側耳3號，為黑龍江省林副特產研究所培育菌株。

1.1.2 試劑

隨機引物購自上海生工，基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，Taq酶及相配套的反應緩沖液購自TaKaRa公司。

1.2 亞側耳基因組DNA提取

采用天根生化科技有限公司的“快捷型植物基因組提取試劑盒”進行DNA提取。

1.3 亞側耳RAPD反應體系設計

1.3.1 基本反應體系及基本反應條件

表1 基本反應體系（25μl體系）

基本反應程序

1.3.2 各反應因素梯度設計

表2 各反應因素梯度設計

2 結果與分析

2.1 亞側耳模版DNA提取結果

將提取的亞側耳DNA進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1）。DNA呈現出一條明亮的譜帶且無明顯的拖尾現象，說明所提取的DNA比較完整，質量較高，可用于RAPD分析。

2.2 引物濃度優化結果

經引物篩選試驗，在100個隨機引物中篩選出S167、S467、S475、S460四個引物，其中引物以S167擴增效果最好，因此選用S167進行RAPD反應體系構建。在引物濃度優化試驗中（圖2）可知，5個引物濃度梯度中，除1號外，其它梯度擴增效果多態性均非常豐富，且條帶清晰。因此，出于成本考慮，選擇2號為最佳引物濃度，即25μL反應體系中添加1.5μL引物。

圖1 亞側耳DNA電泳結果

圖2 引物濃度優化試驗

2.3 模版DNA濃度優化結果

模版DNA濃度優化結果如圖3，其中1號、2號擴增條帶不清晰，擴增效果不好；3號、4號、5號擴增條帶清晰，且呈多態性，出于成本考慮，選擇3號濃度，即25μL反應體系中添加2.0μL模版DNA。

圖3 模版DNA濃度優化試驗

2.4 Taq酶濃度優化結果

Taq酶濃度優化結果如圖4，各濃度條帶均比較清晰，且多態性豐富，其中以2號、3號濃度條件下最為清晰，出于成本考慮，選擇2號濃度，即25μL反應體系中添加0.2μL Taq酶。

圖4 Taq酶濃度優化試驗

2.5 10×PCR Buffer濃度優化結果

10×PCR Buffer濃度優化結果如圖5，以2號濃度最為清晰，因此25μL反應體系中添加2.0μL10×PCR Buffer溶液。

圖5 10×PCR Buffer濃度優化試驗

2.6 dNTP濃度優化結果

圖6 dNTP濃度優化試驗

dNTP濃度優化如圖6，其中1號、2號、3號濃度條件下擴增效果均比較清晰，且條帶呈多態性，其中1號濃度條件下擴增效果最為清晰，因此25μL反應體系中添加3.0μL dNTP溶液。

3 結論

在RAPD反應中，影響PCR反應的因素很多，其中包括PCR緩沖液、dNTP的濃度、循環參數（退火溫度、變溫時間、PCR儀），Taq DNA聚合酶的來源及型號、模板DNA的質量和含量、引物純度及濃度、DNA污染的共抽提和擴增干擾等。本文對RAPD反應體系中的10×PCR Buffer濃度 、dNTP濃度、模板DNA濃度、引物濃度、Taq酶濃度這5個主要影響因素進行了優化，最終確立了亞側耳RAPD－PCR反應體系和反應程序。反應體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.0μL、2.5mM／L dNTPs3.0μL、5U／μL Taq酶0.20μL、5μM／L引物1.5μL、200ng／μL模板 DNA 2.0μL、去離子水16.30μL。PCR 反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，37℃退火30s，72℃延伸2min，40個循環，72℃延伸10min，4℃forever。

［1］ 戴芳瀾.中國真菌總匯［M］.科學出版社，1979.

［2］ Liu Y，Bau Tolgor.A new species of Hohenbuehelia from China［J］.Mycotaxon.2009.

［3］ 劉明，王繼華.DNA分子標記技術.東北林業大學學報，2003，31，（6）：65－67.

［4］ 李三署，林新堅.姬松茸和雙胞蘑菇不同菌株的RAPD擴增研究［J］.食用菌學報，2002，9（3）：1－4.

［5］ 詹才新，朱蘭寶.RAPD技術在金針菇雜交育種中的應用［J］.食用菌學報，1995，2（1）：7－11.