蕨菜孢子組織培養技術的研究1）

郭宇蘭，陳宇

（黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江157011）

蕨菜〔Pteridium aquilinum （L.）Kuhn.〕，又叫拳菜、蕨兒菜、拳頭菜、龍須菜、龍頭菜、如意菜等，屬鳳尾蕨科多年生植物，多野生于陰濕淺山荒坡、半山坡及林下草地。可供食用或釀造，有較高的營養價值和經濟價值。蕨菜因其風味獨特，營養豐富而為人們所喜食。近年來，食用綠色食品極為風行，而蕨菜因其生長在無污染的環境中，是極其優良的綠色食品品種，因而深受國際市場的歡迎。由于對野生蕨菜的過度采集和人為活動對其生存環境的破壞，其產量逐年下降，人工種植蕨菜已經引起人們廣泛關注，保護蕨菜資源，發展人工栽培技術顯得十分必要。通常利用地下莖進行營養繁殖，繁殖系數低，工作強度大，難以進行大面積推廣。利用組織培養技術快繁種苗是滿足蕨菜生產的關鍵。該研究利用蕨菜孢子培養，成功獲得大量的組培生根苗，且移栽成活率較高。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

來源于黑龍江省林副特產研究所采摘的蕨菜孢子，采自2012年6月黑龍江省林副特產研究所實驗地，收集好后，放置4℃冰箱保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌外植體的準備

將采集的蕨菜孢子用無菌濾紙包好，曲別針固定封口。將紙包置于75%的酒精中消毒30s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒，設置60s、120s、150s、180s消毒處理，無菌水清洗洗4～5次，然后用滴管吸取孢子溶液，滴于MS培養基中。每個處理20瓶，3次重復，3d后開始調查污染率，之后每早調查1次，10d后結束調查。

1.2.2 培養條件

本實驗采用MS為基本培養基，附加2%蔗糖，0.5%瓊脂，pH5.8～6.0，植物生長調節劑在滅菌前加入。培養基在121℃高壓滅菌鍋中滅菌30min。培養室溫度控制在（25±2）℃，光強為2500～3000 lx，光周期為光培養16h，暗培養8h。

1.2.3 誘導培養

將外植體接種于 MS、1／2MS、1／4MS培養基中，培養條件同上，每個處理20瓶，9次重復。7d天后開始觀察和調查原葉體的生長情況。

1.2.3 增殖培養

將D 0.5cm原葉體接種到不同附加物的8組培養基進行培養，培養條件同上，觀察培養物分化狀況。每個處理20瓶，9次重復。7d天后開始觀察并記錄生長狀況。

1.2.4 生根誘導

繼代增殖培養后，當試管苗長度有85%以上超過2cm時，取生長旺盛的試管苗進行生根培養，生根培養基為1／2MS＋NAA（0～0.1）mg／L＋IBA（0.1～0.2）mg／L。長度過小的轉接到繼代培養基上繼續進行擴繁培養，以提高材料的利用率。每種處理20瓶，重復9次，30d后統計生根率、根長。

1.2.5 練苗與移栽

當根長4～6cm左右，生長健壯時進行馴化移栽。首先在培養室打開瓶蓋放置5d，然后用鑷子從瓶內取出植株，用自來水沖洗凈附著在根部的培養基，移栽到營養缽中（土∶沙∶腐熟土有機肥＝1∶1∶0.5），套袋保濕，大約一周后，長出新葉，可以去掉遮蓋，放到溫室進行管理。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體成活率的影響

表1 不同消毒時間對蕨菜孢子成活率的影響

表1結果表明，隨著升汞消毒時間的增加，污染率降低，但雖然升汞的消毒效果很有效，卻對外植體的活化和分化等方面產生了一定的影響。由表1可看出：70%的酒精處理30s后，再用0.1%HgCl2處理150s最合適蕨菜孢子消毒。

2.2 不同濃度無機鹽對孢子萌發及原葉體形成的影響

1周后顯微鏡下可觀察到孢子大量萌發，并逐漸形成絲狀體和片狀體，1個月后可形成D 0.4cm左右的原葉體。

表2 不同無機鹽濃度下的孢子萌發情況

由表2可知，蕨菜孢子萌發與無機鹽濃度高低有關，濃度高時抑制孢子萌發，而濃度過低則不利于孢子萌發。適當的無機鹽濃度則有助于孢子萌發及原葉體形成。

2.3 不同激素水平對原葉體增殖的影響

將原葉體分切成0.5cm的原葉體小塊接種到1／2MS＋6－BA（0.5～2.0）mg／L＋NAA（0.05～0.1）mg／L的培養基中，2個月后統計增殖情況。

表3 不同激素水平對原葉體增殖的影響

根據增殖質量和數量來評價激素配比的狀態，從而選出最佳激素配比的培養基。由表3可以看出，3號培養基最合適原葉體的增殖培養。

2.4 不同濃度的生長素對壯苗生根的影響

表3 不同濃度的IBA與NAA組合對試管苗生根的影響

由表3可以看出，試驗蕨菜孢子苗生根培養是以1／2MS為基本培養基，在9種培養基中，小苗均能生根，生根率在5號培養基中最高，達98.6%，生根最快，根系發達、粗壯，且組培苗生長良好，葉片濃綠，小苗長勢較為旺盛，均長有4條以上長度超過7cm的根，且健壯，此時即可出瓶移栽。

2.3 試管苗移栽

當根長2～3cm時進行馴化移栽。首先在培養室將打開瓶蓋放置一周，然后用鑷子從瓶內小心取出植株，出瓶時要小心不要傷到根，用自來水沖洗凈附著在根上的培養基，陰涼處晾干表面水分。移栽到營養缽中（土∶沙∶腐熟土有機肥＝1∶1∶0.5），套袋保濕，第1次澆足水后，1周內不澆水，經常向小盆周圍的地上灑水，保持空氣濕度80%～90%，通風，大約一周后，長出新葉，可以去掉遮蓋，放到溫室進行管理，成活率可達95%以上。

3 結論與討論

本試驗用無菌濾紙打包的方法進行孢子滅菌，操作簡單，節省時間。試驗表明，蕨菜孢子的適宜滅菌方法為：用70%酒精滅菌30s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒150s，無菌水清洗洗4～5次。增殖培養基為1／2MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA 0.05mg／L。生根培養基為1／2MS＋NAA 0.05mg／L＋IBA0.2mg／L，生根率可達98.6%，均長有4條以上長度超過7cm的根。將長勢佳的試管苗進行移栽，成活率可達95%。