水通道蛋白-1在急性肺損傷中的表達及意義

王 晴，劉正娟，馬 樂，趙永利，白雪梅

(大連醫科大學附屬第二醫院兒科，遼寧大連 116027)

水通道蛋白-1在急性肺損傷中的表達及意義

王 晴，劉正娟，馬 樂，趙永利，白雪梅

(大連醫科大學附屬第二醫院兒科，遼寧大連 116027)

［目的］探討水通道蛋白1(AQP-1)在脂多糖(LPS)所致的急性肺損傷(ALI)中的作用。［方法］根據是否腹腔注射脂多糖(LPS)將實驗動物分為脂多糖組(LPS組)及生理鹽水對照組(Con組)，對比兩組動物組織病理學改變、動脈血氣、肺濕/干重比及AQP-1表達的差異。［結果］光鏡下見LPS組肺組織水腫，大量炎性細胞浸潤;LPS組 PO2(55.07±17.02)mmHg明顯低于 Con組(97.35 ±9.37)mmHg，差異有顯著性意義，P＜0.05;LPS組肺濕/干重比(4.93 ±0.16)明顯高于 Con組(4.11±0.69)，差異有顯著性意義，P＜0.05;免疫組化染色顯示:LPS 組的AQP-1蛋白表達減弱，熒光實時定量PCR證實LPS組的AQP-1 mRNA表達較對照組明顯下降(P＜0.01)。［結論］AQP-1參與了急性肺損傷的形成。

急性肺損傷;脂多糖;水通道蛋白-1

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，常成為多臟器功能衰竭的始動因素，發病迅速，缺乏有效的治療方法，且其發病機制仍不十分清楚，因此給臨床治療帶來諸多問題。研究表明水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)與肺水腫有關，水通道蛋白是一組與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白。近年逐漸發現了13種水通道蛋白，其中AQP-1主要分布于肺微血管內皮［1］，對于維持血管與間質之間水運動的平衡有重大意義，它的發現在分子水平揭示了水跨膜轉運調節的基本機制。肺水腫以肺泡和肺間質內液體積聚為特點，發生時必然伴有水轉運紊亂及水通道蛋白功能改變，因此充分認識肺臟水通道蛋白的作用對臨床治療肺水腫具有重要意義。本研究旨在通過對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)導致的 ALI幼鼠AQP-1表達的研究，明確AQP-1在幼鼠ALI發生機制中的作用，為ALI的治療提供新的研究途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性幼年(6～8周齡)SD大鼠20只，體質量150～200 g，購自大連醫科大學動物部。隨機分為兩組:對照組(Con組)、脂多糖組(LPS組)，每組10只。實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要試劑

LPS(0111:B4，Sigma公司)、水合氯醛(中國醫藥集團上海化學試劑公司)、Mayer蘇木素(Sigma公司)、SP試劑盒和DAB試劑盒(武漢博士德生物試劑有限公司)、AQP-1抗體(Chemicon公司)、血氣分析儀(ABL-800)、RT-PCR試劑及儀器均由大連寶生物公司提供。

1.3 動物模型的建立

稱重后，7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定。LPS組經腹腔緩慢注射LPS 5 mg/kg，Con組在相同時間點給予相當量的生理鹽水。LPS或生理鹽水注射6 h后放血處死動物。

1.4 血氣分析

LPS推注30 min及6 h后(處死動物前)，各組經頸外動脈采血1 mL，后立即用自動血氣分析儀測定 pH、PaCO2、PaO2。

1.5 肺濕重/干重比(W/D)測定與病理檢查

取左肺稱濕重(W)后，置70℃溫箱，48 h后(質量不再減輕)稱干重(D)，計算W/D比值。取各標本右下肺葉經10%甲醛固定，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后常規石蠟包埋、切片，蘇木素伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察病理改變。肺損傷病理結果的判斷，根據炎癥和上皮細胞脫落程度將炎癥分為4級:“-”未見明顯炎癥細胞浸潤;“+”少量炎癥細胞浸潤，氣管結構完整;“+++”見大量炎癥細胞浸潤，并可見管壁破壞及(或)上皮脫落;“++”介于“+”和“+++”之間。

1.6 AQP-1的免疫組化染色

右下肺組織經石蠟包埋切片后，檢測AQP-1在肺內的表達。石蠟包埋組織切成4 μm切片，用于H-E及免疫組化染色。切片經常規脫蠟、水化后，用3%過氧化氫去除內源性氧化酶，微波抗原修復，余步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性片作為陽性對照，以 PBS代替一抗作為陰性對照。AQP-1抗體稀釋濃度為1∶100。細胞質呈棕黃色著染者為陽性表達細胞。

1.7 實時定量PCR檢測肺組織AQP-1 mRNA表達

用TRIzol(Invitrogen公司產品)試劑提取右肺中葉組織總RNA，并對其進行Dnase處理，測定在260 nm下的OD值，計算RNA純度及含量。采用熒光實時定量PCR方法檢測AQP-1 mRNA表達水平。試劑盒購置于TaKaRa公司。AQP-1引物上游5'- GACTACACTGGCTGTGGGATCAA -3'，下游5'- CCAGGGCACTCCCAATGAA -3'，由 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System分析儀完成，總反應體積為 25 μL，含有40 pmol各引物，2 μL cDNA。反應條件:95℃ 預變性 5 min，95℃ 20 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，4 0 個循環;以 ACTB(引物上游5'- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3')作為內參照。

1.8 統計學方法

采用SPSS11.0統計軟件進行數據處理分析，各組指標的檢測結果均以均數±標準差(±s)表示，各組均數的比較采用t檢驗，以P＜0.05作為檢驗的顯著性標準。

2 結 果

2.1 動脈血氣比較

所有實驗大鼠吸氧濃度均為21%，故以動脈血氧分壓PO2代替氧合指數進行比較，結果顯示Con組PO2(97.35 ±9.37)mmHg，注射 LPS 6 h 后 PO2(55.07±17.02)mmHg，LPS 組與 Con 組比較 PO2明顯下降，兩組比較差異有顯著性意義，P＜0.05。

2.2 肺濕/干重比(W/D)測定比較

LPS 組肺濕/干重為(4.93 ±0.16)，顯著高于正常Con組(4.11±0.69)，兩組比較差異有顯著性意義，P ＜0.05。

2.3 大鼠肺組織病理改變

光鏡下可見LPS組血管周圍間隙增寬，大量淡粉色網狀結構;肺間隔增寬，有大量炎癥細胞浸潤，以單核巨噬細胞、漿細胞、中性粒細胞為主，可見少量淋巴細胞，部分肺間隔變薄、斷裂，有肺氣腫形成;肺內可見微血栓灶性出血及肺不張;肺泡腔內可見出血、炎癥細胞及液體滲出，分級(+++)。生理鹽水對照組肺間質和肺泡未見炎癥細胞浸潤，分級(-)。見圖1。

2.4 AQP-1蛋白在肺組織中的表達

Con組AQP-1蛋白免疫組化顯示肺組織呈棕黃色，主要在血管內皮細胞、黏膜下腺、氣管上皮細胞、肺泡上皮表達。與正常對照組比較，LPS組肺血管內皮細胞、肺泡上皮細胞呈淺棕黃色，提示AQP-1蛋白表達減弱(圖2)。

圖1 SD大鼠肺組織H-E染色 ×200Fig 1 The pathological examination degree of the two groups

圖2 肺組織AQP-1免疫組化染色 ×200Fig 2 Immunohistochemical analysis of AQP-1 expressed in microvascular endothelial cells

2.5 AQP-1 mRNA在肺組織中的表達

利用熒光實時定量PCR方法檢測肺組織中AQP-1 mRNA表達量，結果顯示:LPS組的AQP-1 mRNA 表達量為(0.34 ±0.08)，較對照組(0.48±0.11)明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)。

3 討 論

急性肺損傷(ALI)是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其發病機制尚未完全闡明，有研究表明LPS是引起ALI的重要致病因子［2-3］。以往人們普遍認為，肺水腫主要是由于肺微血管內皮細胞(LMECs)受損所致，而對肺組織存在的水通道蛋白(AQPs)在病理生理條件下的作用認識不足。AQPs是一類可調節水進出細胞膜的水通道同源蛋白家族的總稱，自從1988年 Agre等發現AQP-1以來，目前在哺乳動物中已發現13種AQPs亞型(AQP0～12)，其主要功能是介導自由水的跨細胞膜轉運，為水的快速轉運提供了一個主要通路。其中分布于肺組織中在肺內液體的吸收及轉運方面具有重要作用的是 AQP -1［4-5］，AQP -1 在細胞膜中由 4 個單體組成，每一個單體含有一個水孔通道，水通過這些高選擇性的通道不需要耗能，同時可阻止離子的通過，因而保持了膜電位的穩定。

AQPs功能均不受溫度和脂質膜成分影響，而且不存在開放和關閉的功能狀態，只要有滲透壓梯度就有水分子順滲透壓梯度通過水孔通道。AQP-1主要負責清除支氣管和脈管周圍組織內的水分，King等［6］人的研究發現正常人靜脈注入大量生理鹽水后造成細支氣管旁水腫，而先天缺乏AQP-1的個體未呈現上述變化。研究顯示，AQP-1基因敲除小鼠與野生型相比，肺內滲透壓依賴被動性水轉運被抑制90%，而且在新生小鼠肺內液體大量吸收的關鍵時期，AQP-1的表達大量增加［7-8］。此外，研究還證實剔除 AQP-1可中度降低靜水壓差所致的跨毛細血管液體轉運，這些研究說明AQP-1在肺水轉運以及肺水腫的發病機理中可能起著重要的作用［9］。

對于AQP-1在肺臟中表達部位的研究，不同文獻報道不一。本研究通過對LPS所致急性肺損傷幼鼠肺組織標本的免疫組化染色證實AQP-1在肺組織的血管內皮細胞、黏膜下腺、氣管上皮細胞、肺泡上皮均有表達。此結果與張成等［10］通過對人體肺組織標本的研究相一致。

然而對于ALI中AQPs在肺組織中的表達增高還是降低，目前仍有爭議。大多數的實驗研究表明ALI后 AQPs表達下降［11］，本研究免疫組化顯示AQP-1蛋白在Con組肺組織呈棕黃色，主要在血管內皮細胞、黏膜下腺、氣管上皮細胞、肺泡上皮表達，而LPS組在肺血管內皮細胞、肺泡上皮細胞表達減弱，呈淺棕黃色。而且熒光實時定量PCR證明LPS組大鼠AQP-1 mRNA表達明顯降低。

本研究結果顯示LPS所致急性肺損傷中幼鼠肺組織濕/干重較正常組升高，同時，AQP-1表達明顯下調，提示AQP-1對間質水腫形成和吸收起重要作用，其機制可能是 AQP-1表達下降會導致跨細胞水轉運的速率降低，從而影響水腫液吸收，這與劉琳等［12］的研究觀點一致。因此，通過提高AQP-1含量或者活性，增強肺水腫患者肺泡水清除率，可能是治療肺水腫的有效途徑，也為急性肺損傷提供了新的治療思路。

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Expression of AQP-1 in acute lung injury induced by lipopolysacharide in rats

WANG Qing，LIU Zheng-juan，MA Le，ZHAO Yong-li，BAI Xue-mei
(Department of Pediatrics，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

Abstract:［Objective］To investigate the expression and effect of AQP-1 in acute lung injury(ALI)induced by lipopolysaccharide.［Methods］Twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into LPS group treated with LPS injection and normal control group injected with saline(Control group).Arterial oxygen tension(PaO2)and wet/dry mass ratio(W/D)were tested at 6th hour after the injection.The expressions of AQP-1 protein in the lungs of rats were detected by immunohistochemistry and the expressions of AQP-1 mRNA were measured by a real-time fluorescence PCR.［Results］The arterial oxygen tension(PaO2)in LPS group was obviously lower than that in control group(55.07 ±17.02)mmHg vs(97.35 ±9.37)mmHg(P＜0.05).The wet/dry mass ratio(W/D)in LPS group was obviously higher than that in control group(4.93 ±0.16 vs 4.11 ±0.69，P＜0.05).The immunostaining showed a significant decrease in the expression of AQP-1 and a real time RT-PCR confirmed that the levels of AQP-1 mRNA were significantly reduced in LPS group(P＜0.01)at 6 h after LPS injection.［Conclusion］AQP -1 has an great effect in acute lung injury(ALI).

Key words:acute lung injury;lipopolysaccharide;aquaporin-1

Q74

A

1671-7295(2012)01-0022-04

遼寧省教育廳高校科研項目(L2010119)

2011-10-18;

2011-12-09

王晴(1987-)，女，遼寧興城人，碩士研究生。

白雪梅，教授。E-mail:xuemei-bai@163.com