高血壓病血瘀證患者血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

胡小勤，陳利國(guó)，曾學(xué)文，戴勇，張敏

(1.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632;3.廣東南海市中醫(yī)院，廣東 佛山 528200)

血瘀證與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)［1］，因此通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察血瘀證患者血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730活性的影響，并與非血瘀證患者血清的作用進(jìn)行比較，可深入探討血瘀證形成的病理機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究了高血壓病血瘀證患者血清對(duì)CRL－1730活性的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(CRL－1730)由美國(guó)ATCC公司提供。

1.2 試劑 F12K培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGS)(北京邁晨科技公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Gibco公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)。

1.3 儀器 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 血清來(lái)源 選取高血壓病血瘀證和非血瘀證患者各20例，為2005年5月～2006年5月廣州華僑醫(yī)院門診及住院確診者。高血壓病診斷符合世界衛(wèi)生組織/國(guó)際高血壓學(xué)會(huì)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。血瘀證診斷符合1986年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。兩組患者均為原發(fā)性高血壓患者，排除靶器官損害或糖尿病。兩組患者在性別、年齡、血壓分級(jí)方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。健康組選擇暨南大學(xué)本科生健康志愿者15人。其血壓在正常范圍，與高血壓病患者血壓比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

2.2 血清收集 高血壓病血瘀證患者、非血瘀證患者及健康人均空腹取血，置入不抗凝干燥試管，自凝后以2 000r/min離心(4℃，15min)，取上清液置無(wú)菌 EP管，凍存于－20℃，備用。用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的血清分別為各組患者的混合血清。

2.3 分組

2.3.1 對(duì)照組 100%DMEM。

2.3.2 血瘀組 分別為5%，10%，15%，20%血瘀證患者血清(DMEM稀釋)。

2.3.3 非血瘀組 分別為5%，10%，15%，20%非血瘀證患者血清(DMEM稀釋)。

2.3.4 健康組 分別為5%，10%，15%，20%健康人血清(DMEM稀釋)。

2.4 細(xì)胞接種及活性觀察 按1×105個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔。培養(yǎng)24h后，換無(wú)血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24h，按血瘀組、非血瘀組、健康組各4組(5%，10%，15%，20%)及對(duì)照組分組，每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)分別培養(yǎng) 6，12，24，48h 后，每孔加入 20μL MTT(5g/L)，孵育 4h，傾去上清液，每孔加 DMSO 150μL，振蕩10min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定吸光度(A)。以空白對(duì)照孔調(diào)零。

3 結(jié)果

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，不同濃度血清作用于CRL－1730不同時(shí)間后細(xì)胞活性比較，見表1～4。

表1 血清作用CRL－1730 6h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

表1 血清作用CRL－1730 6h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 0.68 ±0.142)0.66 ±0.062) 0.73 ±0.06 0.77 ±0.102)非血瘀組 0.76 ±0.062)0.61 ±0.072) 0.73 ±0.03 0.72 ±0.082)健康組1.01 ±0.16 0.92 ±0.06 0.98 ±0.09 1.12 ±0.03

由表1可見，血清作用6小時(shí)后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，20%，15%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 血清作用CRL－1730 24h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

表2 血清作用CRL－1730 24h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 0.86 ±0.11 0.88 ±0.182)0.98 ±0.052)0.93 ±0.072)非血瘀組 0.95 ±0.10 0.90 ±0.172)1.01 ±0.032)1.05 ±0.131)健康組0.99 ±0.10 1.32 ±0.08 1.51 ±0.17 1.94 ±0.14

表3 血清作用CRL－1730 48h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

表3 血清作用CRL－1730 48h后細(xì)胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 1.11 ±0.08 1.37 ±0.021) 1.40 ±0.13 1.38 ±0.072)非血瘀組 1.23 ±0.10 1.35 ±0.041) 1.44 ±0.04 1.42 ±0.102)健康組1.23 ±0.05 1.57 ±0.03 1.47 ±0.07 1.83 ±0.06

由表2可見:血清作用24小時(shí)后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，15%，10%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

從表3可見，血清作用48小時(shí)后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，15%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

總的來(lái)說(shuō)，血清作用6h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細(xì)胞活性較低，20%，15%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.01);血清作用24h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細(xì)胞活性較低，15%，10%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血清作用48h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細(xì)胞活性較低，15%和5%濃度時(shí)差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);各濃度血清作用6，24，48h后，血瘀組與非血瘀組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但血瘀組細(xì)胞活性較非血瘀組有降低的趨勢(shì)。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，血清作用24，48h，血瘀組、非血瘀組細(xì)胞活性較健康組低，在某些濃度時(shí)差異顯著(P＜0.05或 P ＜0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［4－5］。本研究也說(shuō)明，血瘀證患者血清可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，但要選擇合適的作用時(shí)間及合適的濃度。而血瘀組和非血瘀組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但血瘀組細(xì)胞活性較非血瘀組有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明高血壓病患者血清可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的活性，對(duì)細(xì)胞的代謝與增殖有抑制作用。其中，血瘀證患者血清對(duì)細(xì)胞活性的抑制有更明顯的趨勢(shì)。之所以還沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)檠宓淖饔脹]有持續(xù)，下一步如果對(duì)損傷的細(xì)胞進(jìn)行傳代，并繼續(xù)用血清進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)得出不一樣的結(jié)論。

［1］ 李曉，姜萍.血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與血瘀證［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(2):154 －156.

［2］ Chalmers J，Chusid P，Cohan JN，et al.WHO － ISH hypertension guidelines committee.1999 world health organization － international society of hypertension guidelines for the management of hypertension［J］.J Hypertension，1999，17:151 －183.

［3］ 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì).血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987，7(3):129.

［4］ 李正飛，郝斌，楊濤，等.氟伐他汀對(duì)抗磷脂綜合征患者血清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子－1表達(dá)的影響及機(jī)制［J］.中國(guó)藥物與臨床，2010，10(4):418.

［5］ 李小麗，甘華，常曉東，等.尿毒癥患者血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及rhEPO的干預(yù)作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(22):2255.