活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達的影響

白云，李洋，章艷

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦血管病是一種以“發病率高、致殘率高、死亡率高”為特點的嚴重威脅人類，尤其是中老年人健康的常見病、多發病。據近年流行病學調查表明，我國每年死于腦血管病大約100萬人，其中缺血性腦血管疾病占60%～80%。因此，缺血性腦血管疾病日益受到醫藥學界的重視［1］。目前普遍認為，腦缺血是由多種作用機制共同作用的結果，中藥以其多成分、多靶點的特點在腦缺血的防治中具有獨特優勢［2］。活血熄風方是以祛風活血中醫理論指導下提出的新組方。本文旨在通過觀察活血熄風方對MCAO模型大鼠腦皮質cfos蛋白表達的影響，探討其神經保護作用機制，并為研發作用機制明確的防治腦缺血中藥新藥奠定實驗基礎。

1 實驗材料

Wistar大鼠，雌雄各半，體質量(300±20)g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。活血熄風方(按常規方法制成水煎液，4℃保存備用)［3］;銀杏葉片(唐山榮大藥業有限公司);尼莫地平片(西安博愛制藥有限公司);PV6001二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋);c－fos抗體(美國SANTA Cruz公司);Q500IW圖像分析儀(德國Leica);光學顯微鏡(Olympus Japan BH －2)。

2 實驗方法

Wistar大鼠隨機分成7組，為活血熄風方高劑量組(活血熄風方10g/kg)、中劑量組(活血熄風方5g/kg)、低劑量組(活血熄風方2.5g/kg)、尼莫地平組(尼莫地平片21.6mg/kg)、銀杏葉片組(銀杏葉片135mg/kg)、模型對照組和假手術組(蒸餾水2ml/只)。各組均灌胃給藥7天，末次給藥后30min采用 Longa［4］方法，制備大鼠MCAO模型。待大鼠意識恢復后30min后，對其進行神經功能缺損評分，評分在1～3分者納入研究。行為學評分后，各組大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，隨后開胸剪開右心耳，從左心室插管至升主動脈，迅速灌注約150ml肝素化生理鹽水，隨后緩慢灌注0.1mol/L磷酸緩沖液200ml(含4%多聚甲醛)。用剪刀從枕骨大孔剪開，完整取大腦，制作病理組織片，并按照常規免疫組化法檢測各組大鼠腦皮質c－fos蛋白的表達。在缺血周邊區腦皮質選擇5個非重疊視場，于100倍光鏡下計數陽性染色細胞數。實驗結果采用SPSS 11.5 for Windows統計軟件分析處理，采用Test檢驗。

3 實驗結果

免疫組化法檢測活血熄風方對模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達的影響，實驗結果見表1。

表1結果顯示，在24h、48h和72h不同時間點，模型對照組與假手術組比較，c－fos蛋白表達均顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。在24h和48h時間點，活血熄風方高、中劑量組、尼莫地平組、銀杏葉片組分別與模型對照組比較，c－fos蛋白表達均有不同程度的降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。在72h時間點，活血熄風方高劑量組、尼莫地平組與模型對照組比較，c－fos蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 活血熄風方對模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達的影響(n=10，±s)

表1 活血熄風方對模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達的影響(n=10，±s)

注:各組與模型對照組比較，*P＜0.05;模型對照組與假手術組比較，▲P＜0.01。

組別 劑量(mg/kg)個非重疊視場24h 48h 72h活血熄風方高劑量組 10 18.31 ±3.26* 8.88 ±1.25* 5.92 ±1.34陽性細胞表達數(個)/5*活血熄風方中劑量組 5 16.18 ±3.41* 9.89 ±1.87* 6.95 ±1.03活血熄風方低劑量組 2.5 20.34 ±5.15 11.69 ±2.85 7.05 ±3.75銀杏葉片組 135 16.15 ±3.21* 8.23 ±1.16* 7.95 ±1.21尼莫地平組 21.6 14.27 ±3.44* 7.23 ±1.69* 5.12 ±0.39*模型對照組 － 22.10±3.39▲ 12.80±2.50▲ 8.38±2.41▲假手術組4.43 ±0.89 3.82 ±0.86 4.12 ±0.84－

4 討論

腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見病和多發病。近年來，對缺血性腦損傷發生的病理生理機制研究正在不斷深入。目前認為，缺血性腦損傷的發生是由炎癥反應、自由基損傷、酸中毒和細胞凋亡等多種病理生理機制引發的復雜的級聯反應過程，因此尋找一種安全有效且能夠阻斷或減弱缺血性腦損傷級聯反應各個環節的神經保護藥物，也成為各國學者研究的熱點。盡管西藥中神經保護藥物種類繁多，但由于臨床療效有限和不可避免的毒副作用，限制了其臨床應用。而中醫藥具有整體調節和多環節綜合治療的優勢，在防治缺血性腦損傷研究中顯示了較好的療效。活血熄風方是中醫理論指導下提出的新組方，全方以活血化瘀為主，能降低血管的張力，減輕腦動脈壓力。

c－fos是即刻早期癌基因(immediate－early genes，IEGs)中研究最多的一種原癌基因，作為細胞核第三信使分子與c－fos蛋白結合調控轉錄活性，參與包括缺血性腦損傷在內的多種病理反應過程［5］。本研究發現，活血熄風方在24h和48h時間點，活血熄風方高、中劑量組能夠降低模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達。在72h時間點，活血熄風方高劑量組能降低模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達。由此推測，活血熄風方對缺血性腦損傷的保護作用可能與其降低模型大鼠腦皮質c－fos蛋白表達有關。其確切作用尚需通過進一步實驗進行驗證。

［1］ 周鴻雁，毛海峰，王一蓉，等.腦缺血損傷的研究進展［J］.湖南文理學院學報:自然科學版，2005，17(2):72 －75.

［2］ 胡偉東，胡耀祖，黃小平.中藥有效成分對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18(1):92－95.

［3］ 白云，顏培宇，梁穎.活血熄風方對MCAO局灶性腦缺血模型大鼠腦皮質ICAM－1蛋白表達的影響［J］.中醫藥學報，2011，39(1):13－15.

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84 －91.

［5］ 王巖，黃久儀.c－fos原癌基因表達在腦缺血方面的研究進展［J］.上海醫學，2006，29(3):189 －191.