龜鹿二仙膠及其拆方對豚鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原合成的影響※

● 黃遠鵬 李 楠 杜 江 李奕修 王和鳴

骨性關(guān)節(jié)炎(ostcoarthritis，OA)，又稱骨關(guān)節(jié)病，肥大性關(guān)節(jié)病，增生性關(guān)節(jié)病，是一種以軟骨外基質(zhì)缺失及異常重建的退行性疾病［1－2］。其結(jié)構(gòu)性變化特征包括:逐漸喪失關(guān)節(jié)軟骨，在關(guān)節(jié)邊緣骨贅的形成和軟骨下骨囊腫的發(fā)展［3－5］。OA在中醫(yī)理論中屬于“痹證”中“骨痹”范疇，以肝腎虧虛為其根本，故治療上，補肝腎之虛，扶正固本為其治療原則。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能夠有效的減輕OA患者的癥狀，改善其關(guān)節(jié)功能［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能夠有效的促進SD大鼠及豚鼠軟骨細胞的增殖，抑制SD大鼠軟骨細胞的凋亡，能夠促進豚鼠軟骨細胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成［7－9］，驗證了龜鹿二仙膠的補虛作用對OA的影響。本實驗針對人參枸杞在方中配伍的意義而設計，具體報道如下。

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(低糖)、PBS緩沖液、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone)、Ⅱ型膠原酶(Sigma)、兔超敏二步發(fā)免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB染色試劑盒(中衫金橋)、Rabbit Anti－Collagen Type II(Abcam)。

1.2 主要儀器設備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Firce公司212 UV型)、超凈工作臺(蘇凈安泰)、倒置顯微鏡(OLYMPUS IX70型)、萬能研究級顯微鏡(OLYMPUS)、顯微圖像處理系統(tǒng)(Motic Imges Advance 3.2)、數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(Motic Med 6.0)(麥克奧迪)。

1.3 實驗動物 健康1月齡清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重190～210g，實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007－0005;合格證號:0069141。3月齡清潔級豚鼠4只(實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007－0005)，以上動物均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

1.4 實驗藥物 龜鹿二仙膠由龜甲膠(1∶1)、鹿角膠(1∶1)、人參(1∶5)、枸杞(1∶3)四味中藥組成，均為農(nóng)本方中藥配方顆粒，生產(chǎn)批號:龜甲膠A101209－01，鹿角膠 A100010－01，人參 A101134－02，枸杞A100873－02。

2 方法

2.1 動物分組 雄性Wistar大鼠50只，適應性喂養(yǎng)3天后，隨機分為5組，每組10只:分別為生理鹽水(對照)組、龜鹿二仙膠(全方)組、龜板鹿角(龜鹿)組、龜板鹿角人參(龜鹿參)組、龜板鹿角枸杞(龜鹿杞)組，苦味酸標記。

2.2 藥物制備 參照《中醫(yī)骨傷科學基礎》教材，按照龜板9g、鹿角6g、人參6g、枸杞9g的配伍比例定為人的用藥劑量，大鼠給藥劑量根據(jù)人與大鼠按體表面積換算的藥物等效劑量換算公式［10］計算，得出以下給藥劑量:

表1 各味中藥換算后的劑量［g/只(200g)］

2.3 動物給藥及含藥血清的制備 對照組予相應劑量的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥7天，每日清晨一次，每次3ml，最后一次灌藥(灌藥前禁食不禁水12小時)一小時后腹主動脈采血，3000r/min離心15分鐘，取上清，56℃水浴滅活30分鐘，0.22μm微孔濾膜過濾分裝、標記，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 軟骨細胞分離及培養(yǎng) 3月齡豚鼠處死，消毒，取出膝關(guān)節(jié)，在超凈臺上分離關(guān)節(jié)軟骨面，切取軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨剪成約1mm3大小，PBS漂洗，37℃ 5mL 0.2%Ⅱ型膠原酶消化45min，取上清，離心收集細胞，重復4次，將細胞懸液稀釋為2×105個/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5 免疫組化染色檢測各組含藥血清對豚鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原合成的影響 將F1代的細胞以1×104/ml的密度傳代至鋪有4%多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板中，24小時軟骨細胞貼壁后，加入各組含10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，每組4孔，制作細胞爬片，按照試劑盒說明書進行染色，檢測各組Ⅱ型膠原含量。

2.6 圖像分析 免疫組化染色標本均在萬能研究級顯微鏡下觀察，Motic Images Advance 3.2顯微圖像處理軟件采集圖片，每組標本隨機選取6個視野，拍照保存，圖片數(shù)據(jù)采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對圖像進行分析，測定標本中陽性信號平均灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，成組數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗，以 P ＜0.05表示有顯著差異，P＞0.05表示無顯著差異。

3 結(jié)果

免疫組織化學法檢測各組含藥血清對軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原的影響，見圖1～6、表2。可見，五組均有陽性異染，Ⅱ型膠原陽性異染部位為胞漿，呈片狀或團塊狀的棕紅色顆粒染色。圖中，胞核呈藍紫色染色，是經(jīng)蘇木素復染的結(jié)果。其中，全方組異染顏色最深，對照組異染顏色最淺。表2顯示，與對照組比較，四組含藥血清均能明顯的促進豚鼠軟骨細胞合成Ⅱ型膠原(P＜0.05)。全方組藥效高于其他四組(P＜0.05)，龜鹿參組與龜鹿杞組促Ⅱ型膠原合成能力明顯優(yōu)于龜鹿組(P＜0.05)，龜鹿杞組比龜鹿參組效果更佳。(P ＜0.05)。

表2 免疫組化染色檢測各組軟骨細胞Ⅱ型膠原合成的情況(n=6，±s)

表2 免疫組化染色檢測各組軟骨細胞Ⅱ型膠原合成的情況(n=6，±s)

注:與對照組比較:△P ＜0.05;與龜鹿組比較:▲P ＜0.05;與全方組比較:*P＜0.05;龜鹿參組與龜鹿枸組對比:P＜0.05。

組平均灰度值別全方組 141.40 ±1.378△▲龜鹿組 128.49 ±3.384△＊龜鹿參組 133.63 ±2.605△▲＊龜鹿杞組 135.23 ±5.498△▲＊對照組 116.27 ±5.805▲＊

4 討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷和骨質(zhì)增生為特點的非炎癥性疾病。其病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的病變。關(guān)節(jié)軟骨由99%的軟骨外基質(zhì)和1%的軟骨細胞組成，膠原蛋白是軟骨基質(zhì)中最主要的成分之一，約占成人關(guān)節(jié)軟骨干重的2/3［11］。其中Ⅱ型膠原占90%以上，是軟骨保持結(jié)構(gòu)的緊密性和生物力學特性的基礎。其合成及分解的動態(tài)平衡關(guān)系到軟骨外基質(zhì)的合成和降解平衡。因此Ⅱ型膠原的表達正常與否是衡量軟骨細胞反分化和表型異常的重要依據(jù)。豚鼠軟骨的降解與人類OA的發(fā)展非常相似［12］，3月后豚鼠關(guān)節(jié)面粗糙，中央呈現(xiàn)小顆粒并有輕度凹陷，軟骨面無光澤，干燥呈微黃色［13］。因此，本實驗取3月齡豚鼠軟骨細胞作為研究對象。

注:圖1－6為各組含藥血清對豚鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原合成的影響(×200)

中醫(yī)認為OA是受風、寒、濕三邪所致，加以肝血腎精虧虛，氣血不足，筋骨失養(yǎng)，形體疲極而易發(fā)本病。龜鹿二仙膠具有溫腎益精，補氣養(yǎng)血作用。主治腎中陰陽兩虛，任、督精血不足。其中鹿角膠補腎助陽、強筋壯骨，龜甲膠滋陰潛陽、養(yǎng)血補心，兩者一溫一寒，一陰一陽，合用能峻補陰陽以生氣血精髓。人參大補元氣，枸杞補腎益精。四藥合用，為陰陽氣血交補之劑，共具填補精髓、益氣壯陽之功。

實驗中，各藥物組標本均呈現(xiàn)陽性表達，軟骨細胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒或呈團塊狀。全方組、龜鹿組、龜鹿參組、龜鹿杞組對Ⅱ型膠原陽性染色比生理鹽水對照組較深，全方組優(yōu)于三組拆方組。與龜鹿組對比，龜鹿參組與龜鹿杞組效果較佳，其中龜鹿杞組藥效更好。參照前期實驗［7－9］，證實了君藥龜板和鹿角在促膠原合成藥效中發(fā)揮的作用，同時臣藥人參與枸杞能夠促進君藥更好的發(fā)揮藥效，具備明顯的協(xié)同輔助作用。

有研究表明:枸杞提取液能顯著提高小鼠皮膚中SOD的活性，增加皮膚中膠原蛋白的含量［14］。枸杞多糖可以通過抑制腎臟內(nèi)IV型膠原的表達起到腎臟保護作用［15］。可見枸杞對膠原的影響根據(jù)不同組織出現(xiàn)不同的結(jié)果。但前期研究顯示［9］，枸杞單獨并不能有效的促進Ⅱ型膠原合成。可見枸杞在方中起促進君藥龜甲、鹿角藥效發(fā)揮的作用。其中人參雖然有促進效果，但是不及枸杞，其在方中作用有待進一步研究。

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