黃芪多糖對缺血腦損傷大鼠海馬神經遞質及c－fos mRNA表達的影響*

顏 玲， 黃德斌

(湖北民族學院醫學院 ，湖北恩施445000)

現有資料表明，老年性癡呆 (Alzheimer disease，AD)的發病機制主要與神經遞質紊亂、自由基損傷、神經元凋亡等密切相關［1］。中樞神經系統(central nervous system，CNS)神經元軸突的生長是嘌呤敏感機制予以調控的一個基因表達程序［2］。這種特征性的基因表達程序對于已經成熟的中樞神經細胞來說，可被再次激活而誘導軸突生長與延伸［3］。有研究表明，海馬組織在缺血后，其c－fos mRNA的表達明顯增加［2］。這間接說明，至少c－Fos蛋白是促進神經結構重塑并刺激神經生長的重要因素。黃芪多糖(astragalan，AG)是從黃芪(Astragalus mongholicus)中提取的活性化合物，目前對于黃芪多糖的研究主要集中在調節免疫、抗氧化和延緩衰老的研究［1］，但未發現黃芪多糖對于海馬神經遞質和c－fos mRNA表達的研究。本研究采用大鼠大腦中動脈缺血再灌注的模型，探討AG在缺血性腦損傷后，海馬單胺類神經遞質及c－fos mRNA表達的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及分組 經過行為學實驗篩選合格的封閉群Wistar雄性大鼠100只(體重180～220 g)，購于重慶醫科大學實驗動物中心(醫動字4110302)。將大鼠隨機分成假手術組(sham－operated group，SOG)、模型組(model group，MG)、低劑量黃芪多糖治療組(low－dose astragalan treatment group，LAGTG)和高劑量黃芪多糖治療組(high－dose astragalan treatment group，H－AGTG)，每組10只。

1.2 器材及藥品 黃芪多糖(Sigma);氯化 －2，3，5三苯基四氮唑(TTC，Sigma);水合氯醛(上海金貿泰化工有限公司);乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)ELISA檢測試劑盒由研域(上海)化學試劑有限公司提供;去甲腎上腺素/5－羥色胺［norepinephrine(NE)/5－hydrotytryptamine(5－HT)］ELISA檢測試劑盒(96T，上海江萊生物科技有限公司);β－actin引物和c－fos引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供;MK3型酶標儀;立體顯微鏡;單道可調加樣槍;多普勒血流探測儀;全自動生化分析儀;牙科鉆;MG96G型PCR儀由杭州朗基科學儀器有限公司提供;LG2020D型凝膠成像分析系統、JY300+型電泳儀以及JY－SCZ2型電泳槽由北京君意東方電泳設備有限公司提供;A1301026型低溫離心機由上海艾測電子科技有限公司提供;DQ300型Hoefer核酸蛋白熒光定量分析儀(上海吉泰生物科技有限公司提供)。

2 方法

2.1 動物處理［4］各組動物麻醉后(10%水合氯醛300 mg·kg－1，ip)，仰臥位固定，于右腹股溝處切開暴露股動脈并插管備用。于頸正中縱行切開約1～1.5 cm，逐層分離，分別暴露右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈。于插管的股動脈采血(作對照分析)后，MG、L－AGTG和H－AGTG組結扎并切斷頸外動脈及其分支，徹底止血，隨后沿頸內動脈根部結扎其顱外分支(翼腭動脈)，應用文獻［4－5］線栓法，由右頸外－頸內動脈插入絲線(5－0，頭端粘有硅膠，連續而光滑，直徑0.21～0.27 mm)，制造右大腦中動脈阻塞再灌注模型［4］。隨后，沿著頸外動脈殘端插入同樣黑色尼龍絲線，沿頸外動脈與頸總動脈分叉處，輕輕向頸內動脈推進至頸內動脈顱內分叉處［進線長度約(1.7±0.2)cm］，此時流入大腦中動脈的血流可被阻斷。在MG、L－AGTG和H－AGTG組缺血2 h后，輕輕拔退栓線至頸總動脈，按文獻［4－5］要求，缺血性腦損傷組選擇的再灌注時點分別為1 d、3 d和7 d。L－AGTG和H－AGTG缺血2 h后分別每天2 次 ip AG 5 mg·kg－1和15 mg·kg－1(以生理鹽水稀釋成2 mL)，直至處死取材。MG缺血2 h后分別每天2次注射等容量生理鹽水(ip)。SOG任何血管均不予以結扎、剪斷、插管和阻塞再灌流，只是假手術。各組動物室溫均保持在25℃左右，維持正常肛溫為(37.0±0.5)℃。

2.2 神經功能缺損評分(neurologic impairment score，NIPS) 各組大鼠均按文獻［2，4］所擬 NIPS 法在造模前和處死取材前進行評分，即:0分:無神經功能缺失;1分:腦缺血的對側前肢出現屈曲;2分:自由活動時不向對側轉圈，手推腦缺血的對側肩部時，其肌抵抗力降低;3分:自由活動時向對側轉圈，手推腦缺血的對側肩部時，其肌抵抗力降低。

2.3 取材方法 參考文獻［6］，最后1次腹腔注射藥物后，所有大鼠禁食12 h斷頭取血，將頭迅速置于冰塊上開顱取腦，將取出的腦組織置于墊有冰盤的濾紙上，以生理鹽水沖洗3～5次，待腦組織血液清洗干凈后，小心剝去大腦皮層，暴露并剝離出完整海馬，左右兩側切開分離，左側海馬組織作為對照切片。左右兩側以生理鹽水沖洗干凈，用LKBⅢ型超薄切片機從前端開始連續海馬各區冠狀切片各3張(5～8 μm)，立即放入10%甲醛中，在恒溫37℃狀態下，避光進行Bielschowsky嗜銀染色，30 min后觀察切片。每張片每個部位取10個視野，在光學顯微鏡下觀察神經元情況。剩下海馬組織分別迅速放入5 mL的清潔塑料離心管，存冰箱中備用(－85℃)，分別檢測海馬勻漿ACh、5－HT、NE的含量以及海馬內c－fos mRNA表達。

2.4 海馬單胺類神經遞質測定 嚴格按ACh、5－HT和NE的ELISA檢測試劑盒說明進行。

2.5 海馬組織總RNA提取與鑒定 參考文獻［7］，用RT－PCR法半定量分析海馬c－fos mRNA水平(用Trizol試劑提取海馬組織總RNA)。首先吸取60～80 mg海馬組織，加入Trizol 1 mL，用勻漿器勻漿至液態。將勻漿置入1.5 mL離心管中，于25℃靜置3 min后，4 000 r/min(4℃，離心力12 000×g)離心10 min，吸取上清液放入新的離心管，去除不溶組織沉淀。向上清液中加入氯仿200 μL，顛倒混勻15 s，于25℃靜置3 min，按上述操作繼續離心15 min。小心吸取上清液，加入到另一離心管中，加入異丙醇500 μL，搖勻。于25℃靜置10 min后，按上述操作繼續離心10 min，去除上清液，以1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，混勻后，以4℃離心力7 500×g離心5 min，去除上清液，于25℃干燥，沉淀RNA 5～10 min，用DEPC(二乙基焦磷酰胺)處理過的50 μL無菌水溶解RNA，55℃水浴助溶10 min。取5 μL進行瓊脂糖甲醛變性膠電泳鑒定，再取5 μL加入DEPC處理的45 μL無菌水，用核酸蛋白熒光定量分析儀測定RNA含量，余下的RNA液存于－85℃冰箱備用。

2.6 c－fos mRNA的擴增 反轉錄在20 μL反應體積中進行。按文獻［8］用AMV 反轉錄酶0.5 μL(1×107U/L)，dNTP 2 μL(10 mmol/L)，RNasin 0.7 μL(3×107U/L)，于42℃和95℃中分別變性45 min和5 min。PCR反應體系于50 μL中進行。其方法為:c－fos mRNA于94℃、62℃、72℃和55℃中分別延伸45 s、45 s、1 min 以及 5 min。β－actin mRNA 于94℃、58℃、72℃和55℃中分別延伸1 min、1 min、1 min以及5 min，共循環30次。β－actin的PCR產物長度為200 bp，上游引物5'－TCG AAT GGC TCC TAC ATT－3'，下游引物 5'－AGG TCA ACC AGA ACG GCA－3'。c－fos的PCR產物長度為400 bp，上游引物5'－ACG GCA CTT TAT ATT GAC－3'，下游引物為5'－TCC GGC TAT TAA AAT GAT－3'。

3 結果分析、圖像與統計學處理

取PCR產物20 μL與緩沖液均勻混合后，在100V恒壓下于瓊脂糖凝膠中(濃度1.5%)電泳40 min后，將凝膠置于凝膠圖像分析儀(JY04S－3D)上予以分析和拍照，并對膠片灰度掃描，半定量分析目的條帶灰度值與β－actin條帶灰度值的比值。數據以均數±標準差(±s)表示，測得的數據用SPSS 10.0統計軟件處理。用單因素方差分析比較組間差異，兩兩比較用LSD法。神經功能評分用非參數秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AG對腦缺血再灌注大鼠NIPS的影響

結果顯示，各組隨時間延長，其NIPS顯著降低。L－AGTG和H－AGTG NIPS減少明顯強于MG，HAGTG又強于L－AGTG(P＜0.05或 P＜0.01)，呈明顯的劑量依賴性，見圖1。

Figure 1.Effects of AG on NIPS after cerebral ischemia reperfusion in rats.±s.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MG at the same time;△△P ＜0.01 vs 1 d in the same group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 3 d in the same group.圖1 AG對腦缺血再灌注大鼠NIPS的影響

2 腦缺血再灌注大鼠7 d海馬病理觀察

MG、L－AGTG和H－AGTG各時段除右側海馬CA1區有明顯改變外，其它各區與左側非缺血海馬相應各區相似，改變不明顯，正常神經元數量為(150±23)/mm2，無顯著差異(P＞0.05)。SOG左右兩側海馬CA1區未發現明顯的病理改變，神經原纖維排列有序、稀疏，無神經纖維纏結(NFT)，海馬錐體神經元呈錐形，外形規則，細胞膜完整，可見有較大的頂樹突，細胞核多為圓形或橢圓形，核染色質均勻清晰，正常神經元數量為(148±21)/mm2;MG右側海馬CA1區神經原纖維密集、排列紊亂，部分融合，凝集成寬帶狀，銀染加深，部分可見大量NFT，錐體細胞胞漿輕度腫脹，細胞核固縮，核染色質濃縮，核膜不清，正常神經元數量為(87±41)/mm2;L－AGTG 7 d右側海馬CA1區神經原纖維排列部分紊亂，部分密集，可見少許NFT，正常神經元數量為(109±34)/mm2明顯多于 MG而少于 SOG(P＜0.05或 P＜0.01);H－AGTG 7 d右側海馬CA1區神經原纖維病變較MG明顯減輕，神經原纖維排列有序，密集程度明顯緩解，未見NFT，正常神經元數量為(127±28)/mm2，明顯多于 MG和 L－AGTG 7 d而少于SOG(P＜0.05或P＜0.01)。表明AG對缺血區海馬CA1區神經元病理改變具有部分逆轉作用，而且呈現明顯的劑量依賴性，見圖2。

Figure 2.The sections of hippocampus CA1 region(Bielschowsky silver staining，×400).圖2 海馬CA1區切片

3 AG 對腦缺血再灌注大鼠海馬ACh、5－HT和NE的影響

腦缺血再灌注后，各組右側海馬組織ACh、5－HT和 NE含量有顯著差異。其中，MG海馬勻漿ACh和5－HT含量明顯低于SOG(P＜0.01)，表明海馬ACh和5－HT能神經功能降低，AG能顯著增加海馬ACh和5－HT含量，且L－AGTG弱于HAGTG(P＜0.05)，呈現明顯的劑量依賴趨勢;結果還顯示，L－AGTG 7 d和 H－AGTG 7 d海馬ACh和5－HT含量與SOG相當(P＞0.05)，表明AG雖能加速海馬勻漿ACh和5－HT含量的增加，但不能超過正常水平;腦缺血再灌注后，MG 1 d、3 d海馬NE含量顯著低于SOG(P＜0.01)，而后逐漸恢復至正常水平，與SOG相當(P＞0.05)，且其恢復過程L－AGTG和H－AGTG相當(P＞0.05)，見表1。

表1 AG對腦缺血再灌注大鼠海馬ACh、5－HT和NE的影響Table 1.Effects of AG on ACh，5－HT and NE content in rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion(±s)

表1 AG對腦缺血再灌注大鼠海馬ACh、5－HT和NE的影響Table 1.Effects of AG on ACh，5－HT and NE content in rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion(±s)

*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs SOG;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 1d in the same group;▲▲P ＜0.01 vs 3 d in the same group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs MG at the same time;○P＜0.05 vs L－AGTG at the same time.

Group n ACh(μg/g) NE(ng/g) 5－HT(ng/g)SOG 10 176.12 ±21.47 81.78 ±9.24 97.64 ±12.73 MG 1 d 10 98.09 ±17.43＊＊ 44.23 ±8.34＊＊ 51.57 ±15.32＊＊3 d 8 119.06 ±21.13＊＊# 57.17 ±9.73＊＊# 62.63 ±11.74＊＊7 d 9 137.34 ±18.06＊＊## 78.41 ±11.73##▲▲ 73.21 ±15.86＊＊##L－AGTG 1 d 10 103.76 ±25.72＊＊ 51.97 ±10.46＊＊ 57.63 ±18.91＊＊(5 mg·kg－1) 3 d 8 137.12 ±18.43＊＊## 63.63 ±14.74＊＊ 76.42 ±21.34＊＊##7 d 9 165.53 ±20.65##▲▲△△ 85.73 ±18.42## 89.65 ±11.54##△H－AGTG 1 d 8 107.27 ±15.98＊＊ 46.68 ±12.85＊＊ 67.82 ±9.53＊＊(15 mg·kg－1) 3 d 9 154.89 ±19.72*##△△ 64.09 ±14.68＊＊## 92.56 ±8.95##△△○7 d 8 183.71 ±22.48##△△ 83.23 ±16.73##▲▲ 103.74 ±13.46##△△○

4 腦缺血再灌注大鼠海馬β－actin與c－fos mRNA電泳結果

各圖泳道排列為從左至右依次是SOG、MG－7d、L－AGTG 7 d、H－AGTG 7 d 及 DNA marker。海馬RNA甲醛瓊脂糖變性膠電泳為3條帶，即28S、18S和5S，前兩條熒光信號較強，后一條帶熒光信號較弱。RNA的A250和A270比值為0.926，提示RNA的純度可靠，見圖3。β－actin與c－fos mRNA電泳條帶結果表明，L－AGTG 7 d與H－AGTG 7 d熒光信號顯著強于SOG和MG，而且H－AGTG 7 d強于L－AGTG 7 d。提示AG能顯著促進β－actin與cfos mRNA 的表達，見圖4、5。

Figure 3.Hippocampus RNA in 1 d.圖3 各組1 d的海馬RNA條帶

Figure 4.RT－PCR results of hippocampus β－actin in 7 d.圖4 各組7 d的海馬β－actin條帶

Figure 5.RT－PCR results of hippocampus c－fos mRNA in 7 d.圖5 各組7 d的海馬c－fos mRNA條帶

5 大鼠海馬內c－fos mRNA表達的半定量RTPCR測定

MG腦缺血再灌注后，隨時間的推移，海馬cfos灰度值/β－actin灰度值逐漸增加;H－AGTG海馬c－fos灰度值/β－actin灰度值增加顯著強于MG(P ＜0.05)，見表2。

表2 AG對腦缺血再灌注大鼠海馬c－fos mRNA表達的影響Table 2.Effects of AG on c－fos mRNA expression of hippocampus after cerebral ischemia reperfusion in rats(±s)

表2 AG對腦缺血再灌注大鼠海馬c－fos mRNA表達的影響Table 2.Effects of AG on c－fos mRNA expression of hippocampus after cerebral ischemia reperfusion in rats(±s)

*P ＜0.05 vs MG at the same time;△△P ＜0.01 vs 1 d in the same group;▲P ＜0.05;▲▲P＜0.01 vs 3 d in the same group.

Group n c－fos/－actin SOG 10 0.23 ±0.09 MG 1 d 10 0.28 ±0.12 3 d 8 0.32 ±0.11 7 d 9 0.48 ±0.14△△▲▲L－AGTG(5 mg·kg－1)1 d 10 0.24 ±0.08 3 d 8 0.41 ±0.13△△7 d 9 0.53 ±0.13△△▲H－AGTG(15 mg·kg－1)1 d 8 0.25 ±0.16 3 d 9 0.47 ±0.10＊△△7 d 8 0.61 ±0.14△△▲

討 論

黃芪多糖是從黃芪中提取的活性化合物，具有調節免疫、保護腦組織、促進損傷神經恢復、抗氧化、降低血糖、延緩衰老和促進代謝等多種作用［9－10］。但沒有黃芪多糖改善腦神經功能的相關報道，特別是沒有對海馬ACh、NE、5－HT以及c－fos mRNA表達的深入研究報道。本研究發現，黃芪多糖能呈劑量依賴性地減少損傷神經功能評分，改善腦功能狀態，部分逆轉海馬神經元病理改變。

研究證實，海馬神經遞質ACh、NE、5－HT和多巴胺(DA)等的生理功能是增強機體適應力和敏感性，保持覺醒和警覺狀態，確保人體學習力與注意力，促進神經信號傳遞。腦缺血首先導致腦急性能量代謝障礙，使得神經細胞內外離子平衡失調，細胞內積聚大量鈉鈣，導致細胞水腫，甚至破裂［11］。其中，海馬神經元對缺血缺氧性損害極其敏感，特別是CA1區［12］。而海馬又是學習記憶的高級中樞，海馬的相關神經遞質含量直接反映學習記憶力［13］。腦缺血后，海馬的相應神經遞質合成、儲存障礙，導致與學習記憶相關的神經遞質減少，影響學習記憶力［12］。本研究證實，腦缺血后，海馬勻漿與學習記憶有關的ACh和5－HT含量明顯降低，表明海馬ACh和5－HT能神經功能降低。當使用黃芪多糖治療后，海馬ACh和5－HT含量顯著增加，顯著高于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，且呈現明顯的劑量依賴趨勢。這些結果提示，黃芪多糖改善腦功能狀態至少與增加海馬神經元 ACh、NE、5－HT 含量密切相關［11］。其增加這些神經遞質含量的機制，結合黃芪多糖對海馬神經元病理改變研究的結果，認為有可能是通過部分逆轉海馬神經元病理改變或通過某種途徑促進海馬神經元的神經遞質合成。

當腦缺血損傷消除后，受到損傷的神經元就會逐漸修復，其修復再生過程必然伴隨相關物質的表達［11］。相關研究報道，對記憶力具有雙向影響作用的c－fos mRNA在一定范圍內的表達，能改善學習記憶力［14］。c－fos早期在腦中參與神經元信號的整合、轉導、分析與凋亡，與學習記憶及認知功能相關［13］。其中低水平的c－fos表達，可能直接參與了神經元的分化、生長、學習記憶以及神經突觸的可塑性變化等多種生理過程［8，10］。其機制是 c－fos基因影響轉錄和翻譯控制下游靶基因轉錄而合成新的蛋白質，影響學習記憶編碼，從而有利于學習記憶［13］。有研究報道，單純腦缺血再灌注，海馬CA1區c－fos原癌基因產物Fos有較高的表達，能促進損傷神經元的再生與重塑，加速缺血損傷后神經元的修復［14］。這些表明，誘導腦內c－fos基因的表達，都能增強人腦的學習記憶能力［9］。本研究發現，使用黃芪多糖治療大鼠的海馬CA1區神經原纖維病變較模型組明顯減輕，神經原纖維隨劑量增加和時間推移逐漸排列有序，密集程度明顯緩解，NFT最后消失，正常神經元數量明顯多于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。表明AG呈劑量依賴趨勢地部分逆轉海馬神經元病理改變。研究還證實，假手術組海馬的c－fos mRNA表達顯著低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，表明腦缺血因素導致海馬c－fos mRNa表達的增強，通過促進下游基因的表達而保護神經細胞。黃芪多糖治療組海馬c－fos mRNA表達均高于模型組(P＜0.05)，提示黃芪多糖可上調c－fos mRNA的表達。由此可以推論，黃芪多糖減少大鼠腦損傷神經功能評分，可能是通過上調c－fos mRNA的表達，控制下游靶基因轉錄而合成新的蛋白質，重現學習記憶編碼，從而減輕海馬神經元的凋亡，加速神經元的分化、生長，促進神經元的再生與重塑，增強神經元信號的整合、轉導與分析，最終有利于改善學習記憶及認知功能［13］。這種上調c－fos mRNA表達的機制，我們將進一步研究。

［1］ 焦俊霞，高維娟，錢 濤，等.黃芪有效成分對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元Cyt－c、CcO表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(2):211－215.

［2］ 張雅麗，高維娟，閆鳳霞，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞凋亡的研究［J］.中國老年學雜志，2009，29(7):793－796.

［3］ 靳 榕，蔣新穎，馬 行，等.γ－羥基丁酸受體在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用［J］.藥學學報，2007，42(8):838－842.

［4］ 李 花，鄧常清，陳北陽，等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后Caspase表達的影響［J］.中國藥理學通報，2006，22(2):189－193.

［5］ 黃德斌，董 志.尼莫地平對缺血性腦損傷大鼠神經細胞黏附分子表達的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(5):640－643.

［6］ Bracha HS，Garcia－Rill E，Mrak RE，et al.Postmortem locus coeruleus neuron count in three American veterans with probable or possible war－related PTSD［J］.J Neuropsychiatry Clin Neurosci，2005，17(4):503－509.

［7］ Ning X，Liu Q，Zhao H.Nimodipine for treatment of perifocal edema following aspiration and drainage in patients with cerebral hemorrhage［J］.Neural Regener Res，2007，2(5):310－313.

［8］ 葉冬青，高維娟，錢 濤，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元JNK3的表達［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):77－82.

［9］ 湯 諹，李樹清，李 凡，等.缺血后適應對樹鼩海馬CA1區神經元Akt信號轉導調控的機制研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):560－565.

［10］ Junttila MR，Li SP，Westermarck J.Phosphatase－mediated crosstalk between MAPK signaling pathways in the regulation of cell survival［J］.FASEB J，2008，22(4):954－965.

［11］ Sayeed I，Parvez S，Wali B，et al.Direct inhibition of the mitochondrial permeability transition pore:a possible mechanism for better neuroprotective effects of allopregnanolone over progesterone［J］.Brain Res，2009，1263:165－173.

［12］ 焦俊霞，高維娟，李玉明，等.黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元Bcl－2和Bax表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(5):905－910.

［13］ 李 慢，韓 芳，石玉秀.細胞色素C氧化酶在PTSD大鼠藍斑神經元過表達［J］.解剖科學進展，2010，16(2):140－142.

［14］ Ding J，Han F，Shi Y.Single－prolonged stress induces apoptosis in the amygdala in a rat model of post－traumatic stress disorder［J］.J Psychiatr Res，2010，44(1).48－55.