磷酸二酯酶4D基因SNP83位點與新疆維吾爾族、漢族缺血性腦血管疾病的相關性☆

馬建華 裴靜 張小寧

缺血性腦血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是一類多基因疾病，其發生與個體遺傳易患性和環境因素的相互因素有關[1]。其中磷酸二酯酶 4D基因(phosphodiesterase 4D，PDE4D)與ICVD有一定關聯[2]。新疆是多民族聚居區，維吾爾族和漢族是新疆的主要民族，約占新疆人口的85%。新疆維吾爾族持有自己相對獨特的生活方式，人口流動性小，遺傳背景及生活方式較一致，是遺傳學研究的很好自然人群。其與漢族不同的遺傳背景可能存在遺傳易感基因的差異性。我們對新疆地區的維吾爾族、漢族ICVD患者和正常人的PDE4D基因分型進行檢測，主要為了分析新疆維吾爾族和漢族ICVD患者PDE4D基因SNP83位點基因型及等位基因頻率的分布以及兩個不同民族之間是否存在差異性，進一步探討PDE4D基因SNP83位點多態性與新疆地區不同民族ICVD患者發病的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 新疆醫科大學第一附屬醫院、喀什地區第二人民醫院、阿克蘇地區第一人民醫院的神經內科自2007年12月至2009年12月入院的ICVD患者，對照組為同期健康體檢者和在上述三所醫院外科系統住院治療的其他無腦梗死疾病患者。所有入選者均為長期生活在新疆地區的維吾爾族和漢族人。

1.1.1 病例組 入選標準：符合“第四屆腦血管病會議的腦血管疾病診斷要點”所制定的診斷標準[3]，經頭部CT檢查除外腦出血。排除標準：無癥狀及體征的靜止性腦梗死，包括TIA，拒絕參與登記調查。

1.1.2 對照組 入選標準：為同期健康體檢者和在上述三所醫院外科系統住院治療的其他無腦梗死疾病患者。排除標準：既往卒中或TIA史，有過顱內外動脈狹窄血管成形術者；發病時有嚴重的心臟病、心功能不全、肝功能障礙、腎功能不全、呼吸衰竭、惡性腫瘤等；精神病患者；服用抗凝、抗血小板藥物者；自身免疫性疾病；血液系統疾病；6個月內外傷手術史、3個月內感染性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每例對象抽取靜脈血 2 mL，EDTA抗凝，-70℃凍存。用北京百泰克中量全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 PDE4D基因 SNP83位點的 PCR擴增 采用PCR擴增PDE4D基因SNP83位點，引物按參考文獻[4]設計，由上海生工生物工程技術有限公司合成。上游引物序列5′-GATTTATGTCTTATACTTTC-3′； 下游引物序列 5′-TGCTTTTTGAAGATGCATACTTTGT-3′。該序列所擴增產物為368 bp，中間包括一個對應于內切酶TaiI酶切位點，由此形成限制性片段長度多態性。PCR反應體系：總體積為25 μL，包括 Mix 12.5 μL(含有 3 mmol／L Mg Cl2、0.5 mmol／L dNTP、和 2× PCR 緩沖液)，上下游引物各 0.5 μL，基因組 DNA 2.0 μL，去離子水 9.5 μL。PCR擴展循環參數：94℃預變性5 min；反應循環：94℃變性 30 s；52℃ 退火 30 s；35 個循環后；最后72℃繼續延伸10 min后降至4℃終止。

1.2.3 PCR產物的內切酶消化 檢測 PDE4D基因 SNP83位點擴增產物后，PCR 產物 10 μL，10×buffer R 2 μL，TaiI 10 U，滅菌去離子水補充體積至31 μL，置65℃恒溫水浴箱內消化過夜。酶切產物經5%瓊脂糖凝膠電泳，70 V電壓，凝膠電泳分離后。EB染色并于紫外燈下觀察，凝膠成像系統(Unvitec，BTS-20M)照相、分型。

1.2.4 統計學方法 數據分析采用 SPSS 13.0軟件包進行處理。應用等位基因頻率＝等位基因陽性數／總基因數(患者數 ×2)，計算出病例組和對照組PDE4D基因SNP83位點基因型頻率和等位基因頻率，經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律做吻合度檢驗。計量資料的比較先行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合條件者采用t檢驗，方差不齊者采用秩和檢驗；應用χ2檢驗比較兩組PDE4D基因SNP83位點基因型和等位基因頻率分布，通過計算比值比(odds ratio，OR) 對 ICVD與 PDE4D基因SNP83各等位基因進行關聯分析并檢驗。檢驗水準為α＝0.05。

2 結果

2.1 一般資料 ①病例組：入院207例缺血性腦血管病患者，其中維吾爾族109例、漢族98例，男女比例為151∶92，年齡范圍 22～85歲，平均年齡為(58.70±8.10)歲；② 對照組共入選 216名，其中維吾爾族110名、漢族106名，男女比例為119∶97，年齡范圍20～85歲，平均年齡為(56.87±9.70)歲。

2.2 PDE4D基因 SNP83位點多態性檢測 以TaiI酶切PCR產物時，突變純合子(T／T基因型)不能被切開，酶切后僅見與PCR擴增產物一樣的368 bp片段；野生型(C／C基因型)全部能被TaiI酶切割，酶切后可見216 bp及152 bp兩個片段；突變雜合子(C／T基因型)中，只有C等位基因被TaiI酶切割，酶切后可見368 bp、216 bp、152 bp 3個片段。見圖1。

圖1 1：DL2000 marker； 2、6：T ／T；3、7：C ／C； 4、8：C ／T

2.3 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗 病例組與對照組基因型的觀察值和期望值均符合Hardy-Weinberg的平衡法則，吻合度檢驗良好(病例組χ2＝0.616，df＝2，P＞0.05；對照組χ2＝3.163，df＝ 2，P ＞ 0.05)。

2.4 PDE4D基因型和等位基因頻率分布 從表1可見，病例組CC基因型及C等位基因增多，TT基因型減少，病例組與對照組間PDE4D基因的C／C基因型、T／T基因型及C等位基因分布的差異具有統計學意義(P＜0.05)，攜帶C等位基因個體發生ICVD的危險性高于攜帶T等位基因個體，其OR 值為 4.023(95%CI：1.308～12.368，P ＜ 0.05)。

2.5 新疆維、漢兩民族PDE4D基因型和等位基因頻率分布 表2可見維、漢兩民族PDE4D基因SNP83位點基因型分布均以C／C型為主，且維、漢兩民族之間PDE4D基因SNP83位點基因型和等位基因頻率的分布差異有統計學意義(P＜0.05)。在同一民族中，維族ICVD組與對照組間PDE4D基因SNP83位點各基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，而在漢族ICVD組與對照組間基因型和等位基因頻率分布差異有統計學意義(P＜0.05)，且在漢族攜帶C等位基因個體發生ICVD的危險性高于攜帶T等位基因個體，其OR 值為 2.679(95%CI：1.471～4.880，P ＜ 0.05)。

2.6 不同性別PDE4D基因型和等位基因頻率分布的比較 從表3可見，在女性ICVD組與女性對照組PDE4D基因SNP83位點基因型頻率和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)。在男性ICVD組與男性對照組間PDE4D基因SNP83位點的基因型頻率和等位基因頻率的分布差異有統計學意義(χ2＝ 7.577，P ＜ 0.05)，且 C／C 基因型頻率分布在ICVD組與對照組間差異有統計學意義(χ2＝4.246，P＜0.05)，并發現攜帶 C 等位基因的男性個體發生ICVD的危險性顯著增加，其OR值為6.486。

表1 病例組與對照組PDE4D基因型和等位基因頻率分布

表2 新疆維吾爾族、漢族PDE4D基因型和等位基因頻率分布

表3 不同性別PDE4D基因型和等位基因頻率分布

3 討論

2003 年，Gretarsdottir等[2]卒中基因解碼科學小組人員在冰島人群中首次發現了與家族性缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases，ICVD)相關的基因：磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)基因與腦動脈粥樣硬化的發生、發展有關。該基因和以往認識的與高血壓、糖尿病、血脂代謝異常等腦血管病危險因素的相關基因不同，被認為是21世紀首先、也是迄今唯一新發現的卒中候選基因[5]。

本研究首次報告了新疆地區維吾爾族和漢族ICVD中PDE4D基因存在SNP83位點多態性。結果顯示在ICVD組和對照組中均以C／C基因型頻率最高，攜帶C等位基因個體發生ICVD的危險性高于攜帶T等位基因個體，其OR值為4.023(95%CI：1.308～12.368，P ＜ 0.05)。 這與上述國內外報道的結果基本一致。但目前也有一些相反的報道。如日本最近[6]一項研究經多重比較校正后，并未發現該位點與ICVD有相關性。荷蘭[7]對一個地理相對封閉的人群進行SNP83及它們衍生的單倍型進行檢測，與ICVD無相關性。導致這種情況的可能原因是：①在不同種族人群中PDE4D基因SNP83的基因型和等位基因頻率分布存在差異；②對ICVD的納入標準存在差別；③分析的ICVD例數較少。故認為攜帶C等位基因個體發生ICVD的危險性高于攜帶T等位基因個體尚有大量的研究得以證實。

在我們的研究顯示：在同一民族中，在漢族ICVD組與對照組間基因型和等位基因頻率分布差異有統計學意義，且在漢族攜帶C等位基因個體發生ICVD的危險性高于攜帶T等位基因個體，其OR 值為 2.679(95%CI：1.471～4.880，P ＜ 0.05)。而在維吾爾族中未發現PDE4D基因SNP83多態性與維族ICVD的發病有關聯。在不同種族人群中PDE4D基因多態性的研究結果并不一致。美國對以高加索人為主的人群為研究對象[8]，結果發現與SNP83位點與大動脈硬化性腦梗死有明顯的相關性。與美國學者 SongQ[9]和巴基斯坦學者SaleheenD 等[10]以得出了一致的結論。 Banerjee 等[11]以印度人群為主的人群為研究對象，結果表明PDE4D基因SNP83位點C／C等位基因型和ICVD明顯相關。導致這一結果的原因如下：①種族之間遺傳因素存在差異；②新疆地區維吾爾族人群中可能存在有其他未知的生活習慣和環境因素對ICVD的發病的影響。因此還需大量研究加以證實。

本研究結果顯示：男性ICVD組與男性對照組間PDE4D基因SNP83位點的基因型頻率和等位基因頻率的分布差異有統計學意義，且C／C基因型頻率分布在ICVD與對照組間差異有統計學意義，并發現攜帶C等位基因的男性個體發生ICVD的危險性顯著增加。提示在維、漢兩民族男性ICVD患者的發病與PDE4D基因SNP83多態性存在關聯。我國曹軍[12]等發現男性發生ICVD高于女性的30%。目前認為男性患病率高可能與男性體內激素變化特點和接觸危險因素(吸煙、飲酒等)相對女性要多些有關。此外，兩性ICVD發病有不同遺傳背景和遺傳因素，還需大量的研究進一步證實不同遺傳因素與PDE4D基因SNP83多態性之間是否存在關聯。

綜上所述，本研究就新疆地區維吾爾族和漢族在ICVD患者PDE4D基因83位點的多態性進行分析，探討了其與ICVD的關系。發病上可能有不同的遺傳易感因素，但對PDE4D基因SNP83與ICVD的確切關系以及它是如何與其它致病基因相互作用引發ICVD的，仍有待進一步研究。

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