血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因多態性與缺血性卒中的相關性研究☆

龍厚元 代偉 張鯤鵬 宋玉強 謝安木

血小板膜糖蛋白受體P2Y12(platelet membrane receptor P2Y12)在血小板聚集中發揮著特別重要的作用，在動脈血栓形成中起到重要作用[1]。近年來探討血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因位點多態性與缺血性卒中的相關性已經成為一個重要的研究領域。本項研究檢測血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因-T744C位點的多態性與缺血性卒中的相關性，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組165例相互無血緣關系的缺血性卒中患者，其中男86例，女79例，平均年齡(66.06±7.93)歲。所有患者均為青島大學醫學院附屬醫院神經內科住院的缺血性卒中患者(入院時間為2011年5月至2012年5月)，并經顱腦CT或MRI檢查確診。納入標準：符合全國第四屆腦血管病會議制定的診斷標準[2]。排除標準：①有心房纖顫的患者；②有外傷手術史的患者；③有血液系統疾病、腫瘤、自身免疫疾病的患者；④有心、肺、肝、腎功能不全的患者。對照組152例，其中男81例，女 71例，平均年齡(64.5± 16.57)歲，均為青島大學醫學院附屬醫院體檢中心同期的健康體檢者，并行顱腦CT或MRI排除腦血管疾病。記錄臨床資料主要包括年齡，性別，高血壓，糖尿病，高脂血癥。高血壓的診斷標準是按照衛生部疾病控制局頒布的《2010年修訂版中國高血壓防治指南》的規定，并且除外繼發性高血壓。高脂血癥的診斷依據是中國成人血脂異常防治指南制訂聯合委員會2007年制定的 《中國成人血脂異常防治指南》的診斷標準。糖尿病的診斷依據是美國糖尿病協會頒布的《2010年ADA糖尿病診療指南》中的診斷標準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法 病例組和對照組均禁食12 h后抽取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，溶液型法提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR-RFLP) 用 Primer-Premiers軟件設計擴增-T744c多態位點引物上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游 5′-CCA-CAATAGGCCTATAATG-3′。引物由美國Invitrogen公司合成。PCR擴增反應體系為10 μL，Tap PCR MasterMix 5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上下游引物各0.2 μL，超純水 3.6 μL。 用 PCR 儀進行擴增，反應條件為 95℃預變性 5 min，95℃變性30 s，58℃退火 36 s，72℃延伸 30 s，共 35個循環，最后 72℃延伸10 min。待PCR反應完成后，取5 μL PCR產物經含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠電泳系統下確認擴增的252 bp片段為目的產物。

1.2.3 酶切反應 酶切反應體系總量10 μL，用TaiⅠ限制性內切酶 0.5 μL、10X buffer 0.7 μL、PCR 擴增產物3 μL，最后加超純水至10 μL進行酶切，65℃水浴8 h。經含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察結果，判斷基因型。酶切電泳結果(見圖1)，產物是163、89 bp的片段為CC型，252 片段為 TT 型，252、163、89 bp 的片段為 TC型。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，病例組和對照組的計量資料采用(x±s)描述，計量資料數據分析采用方差分析；計數資料數據分析采用卡方檢驗。采用Logistic回歸模型分析影響缺血性卒中的相關因數，檢驗水準α＝0.05。

圖1 T744c酶切后產物

2 結果

2.1 臨床資料 病例組和對照組間性別構成、年齡比較差異均無統計學意義(χ2＝0.043，t＝-1.86，P﹥0.05)，但病例組和對照組間高血壓、糖尿病、高脂血癥比較差異均有統計學意義(χ2＝15.47，χ2＝ 10.29，χ2＝9.17，P﹤0.05或者 P﹤0.01)(見表1)。

表1 病例組與對照組臨床資料比較

2.2 基因型和基因型頻率 病例組TC／CC基因型頻率(43.61%)明顯高于對照組的(28.95%)，且差異有統計學意義(χ2＝ 4.73，P﹤0.05)。C 等位基因頻率病例組為22.03%明顯高于對照組的 15.46%，且差異有統計學意義(χ2＝5.80，P﹤0.05)(見表2)。

2.3 多因素Logistic回歸分析 經多因素Logistic回歸校正年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥后，以健康對照組為參照系，相對于TT基因型，TC／CC型患缺血性卒中的相對危險度為 1.65，95%CI：1.03～2.75，P＝0.04。

3 討論

研究證實通過激活Gi信號傳導通路可以引起血小板聚集導致血栓形成[3]。Gi信號傳導通路主要抑制血小板腺苷酸環化酶的活化，其傳導主要由P2Y受體中的 P2Y12受體介導[4]。血小板膜糖蛋白受體P2Y12是ADP受體兩個重要的止血及凝血介質之一[3]，在 ADP與 P2Y12受體結合后，P2Y12受體與 Gi蛋白耦連[5]，同時刺激血小板顆粒分泌出血栓素A2，激活纖維蛋白原受體(糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受體)，從而使血小板的聚集[6]，因此血小板膜蛋白 P2Y12受體基因多態性可通過影響血小板的功能，導致血栓形成。

表2 病例組與對照組-T744c基因多態性分布頻率比較

研究證明血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因參與了敲除小鼠模型凝血機制環節的啟動[7]，也有研究推測人類該基因缺陷者凝血機制同樣也會出現障礙[8]，國外有研究證實了血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因多態性與動脈血栓的形成有顯著的相關性[1]。目前國內外對血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因與血栓性疾病的關系及與氯吡格雷等藥物相關性研究較為普遍[9-10]，但于血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因位點多態性作為獨立因素影響缺血性卒中的研究仍然不夠完善，在缺血性卒中的作用機制仍然需要進一步研究。

本研究結果表明，病例組和對照組間性別構成、年齡比較差異均無統計學意義(P﹥0.05)，而高血壓、糖尿病、高脂血癥比較差異均有統計學意義(P﹤0.05或者P﹤0.01)。由于CC型基因較少合并與TC型基因組進行統計學分析。病例組TC／CC行基因頻率(43.61%)明顯高于對照組的(28.95%)，且差異有統計學意義(χ2＝4.73，P﹤0.05)。C等位基因的頻率(22.03%)也明顯高于對照組的(15.46%)，且差異有統計學意義(χ2＝5.80，P﹤0.05)。經多因素Logistic回歸校正年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥后，以健康對照組為參照系相對于TT基因型，TC／CC型患腦卒中的相對危險度為1.65。推測血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因-T744C位點多態性與缺血性卒中具有相關性，其TC／CC型可能是腦卒中患者易感危險因素之一，其中等位基因C可能是缺血性卒中的致病因子。此外，本研究樣本量偏少可能會降低群體的代表性，不同人群的遺傳因素也存在差異，這種差異可能導致研究結果存在差異。如果能進行較大樣本、多種因素、多項指標的綜合分析則能到得更完善的結論。

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