尼莫地平對兔早期脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

張國臣 吳新建 郭少雷 張弩 張恒 齊鐵偉

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemicreperfusion injury，SCII)是指所有導致脊髓缺血性損傷的因素去除后，脊髓恢復血供，神經功能障礙沒有得到應有的改善，反而在原缺血性損傷的基礎上進一步加重，甚至在病理上出現不可逆性脊髓神經元遲發性死亡的現象[1-2]，屬于原發性脊髓損傷的繼發性損害。臨床上常見于脊髓內顯微外科手術、各種類型脊髓損傷、胸腹主動脈手術等。國內外文獻報道尼莫地平對SCII是否有保護作用仍有異議[3-6]，而我們在臨床工作中發現尼莫地平對SCII有一定治療效果，故設計本實驗探討尼莫地平對SCII的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年新西蘭大白兔18只，雌雄不限，體質量(2.5±0.5)kg，購于廣東省實驗動物中心。尼莫地平注射液購自德國拜耳公司。

1.2 SCII模型的建立及分組 參照文獻建立缺血再灌注模型[7-9]：實驗動物術前禁食約12 h。速眠新Ⅱ(0.2 mL／kg)肌肉注射加3%戊巴比妥(1 mL／kg)靜脈注射復合麻醉。然后將兔全身肝素化(200 U／kg)，取腹部正中偏左約1.5 cm縱向手術切口開腹，充分顯露腹主動脈，游離左側腎動脈至雙側髂總動脈分叉處之腹主動脈，輕輕翻轉腹主動脈，辨認腹主動脈背側發出的腰動脈。自上向下分別為下 L1、下 L2、下 L3、下 L4、下 L5 動脈[9]，取四個動脈瘤夾分別夾閉下L1、下L2、下L3、下 L4動脈后計時，90 min后逐一取下動脈瘤夾使腰動脈再灌注，逐層關腹。研究對象隨機分為3組：假手術組、對照組、尼莫地平組，每組6只，置于相同環境飼養，每籠1只。其中尼莫地平組：開腹后行目標腰動脈夾閉90 min，術后1 h開始靜脈注射尼莫地平注射液0.17 mg／(kg·次)+生理鹽水(稀釋為 10 mL，每 8 h一次，每次注射 15 min)；假手術組：開腹后行目標腰動脈暴露90 min，術后1h同方法同頻率注射同體積生理鹽水；對照組：開腹后行目標腰動脈夾閉90 min，術后1h同方法同頻率注射同體積生理鹽水。

1.3 Reuter 評 分 Reuter 感覺運動評分[10]標準：①牽張反射(0正常，1輕微反射亢進或減弱，2反射亢進或消失)；②疼痛回縮反射(0靈活的，1緩慢笨拙的，2消失)；③背部感覺(0完全正常，1部分正常，2消失的)；④肌張力(0正常，1張力減退或亢進，2張力消失或痙攣狀態)；⑤后肢運動能力(0可行走，1僅能站立，2可自由活動后肢，3不能活動后肢)。每8 h靜脈注射藥物前評定一次，每次各研究對象評定2 min。各組各個時間點的Reuter評分為5項評分的總和。

1.4 動物標本摘取、染色及觀察 3 d后速眠新Ⅱ加3%戊巴比妥復合麻醉，仰臥位固定，開胸暴露心臟，經主動脈弓先后灌注磷酸鹽緩沖液和40 g／L 的多聚甲醛各 1000～1500 mL[7]，再將兔俯臥位固定，背部正中切開，分離椎旁肌肉，剪除L4～L7棘突和椎板，暴露硬脊膜，縱向切開，截取腰段脊髓組織(L5～L7)放入10%福爾馬林溶液內固定2～5 d。所取標本均行常規蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、甲苯胺藍尼氏染色法(tolridine blue Nissl staining)和免疫組織化學染色鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin-perosidase，SP)法。染色成功后按照Rexed脊髓灰質分區標準[11]取脊髓前角視野(8～9區)觀察，比較三組之間脊髓灰質前角整體細胞結構、正常尼氏小體數量、免疫組化表達程度等。染色指數(staining index，SI)作為免疫組化半定量評價指標，SI＝染色區域比例×染色強度，染色區域比例計分：根據染色區域占觀察區域的百分率分為四級，1級(≤25%)、2級(＞25%，≤50%)、3 級(＞50%，≤75%)、4 級(＞75%)，分別記1～4分。染色強度計分：按染色深淺分四級，1級(無染色)、2 級(弱陽性，呈淺黃色)、3 級(中等陽性，呈棕黃色)、4級(強陽性，呈棕色)，分別記 1～4分。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 19.0處理數據。Reuter評分資料、尼氏小體計數資料和染色指數資料用[M(QL，QU)]表示，采用 Wilcoxon 秩和檢驗兩兩比較并用Bonferroni法調整檢驗水準為α′α＝ 0.05，α′＝ 0.05／3 ＝ 0.017。

2 結果

2.1 Reuter感覺運動評分 表1顯示假手術組和對照組、假手術組和尼莫地平組之間有明顯差異；對照組和尼莫地平組之間在第1 d、第2 d時差異無明顯統計學意義(T1d＝36.00，P1d＝0.61＞0.017；T2d＝33.50，P2d＝0.29＞0.017)。 而在第 3 d時差異有明顯統計學意義(T3d＝25.00，P3d＝0.01＜0.017)。

表1 Reuter感覺運動功能評分M(QL，QU)

2.2 脊髓組織病理學觀察 HE染色可見假手術組脊髓灰質前角整體結構清晰、完整，可見較大的輪廓清晰、結構正常的運動神經元，未見明顯炎癥細胞浸潤、出血、水腫、空泡樣變化等異常(圖1A)；對照組脊髓灰質前角結構紊亂，可見局部中重度水腫、空泡樣變，神經元及膠質細胞損傷較重，未見結構明顯的正常運動神經元(圖1B)；尼莫地平組脊髓灰質前角結構紊亂較對照組輕，局部輕中度水腫、空泡樣變，可見明顯紅色神經元的存在(圖 1C)。

尼氏染色可見假手術組脊髓灰質前角內尼氏小體結構清楚，胞漿內所見嗜堿性顆粒分布均勻，數量較多(圖2A)；對照組未見正常尼氏小體結構，僅見少量中央性尼氏小體溶解后殘留的嗜堿性顆粒(圖2B)；尼莫地平組可見少量正常結構尼氏小體，且可見胞質中央尼氏小體溶解尚未消失的嗜堿性顆粒聚集(圖2C)。各組尼氏小體計數結果見表2，三組之間，兩兩比較差異均有統計學意義(T＝21.00，P＜0.017)。

神經膠質原纖維酸性蛋白的表達，假手術組未見脊髓前角明顯條索狀、棕黃色顆粒表達(圖3A)；對照組見大量條索狀、棕色顆粒樣GFAP表達，表達面積較廣，染色較重(圖3B)；尼莫地平組亦可見類似的棕黃色顆粒，但較對照組表達面積小，染色程度較輕(圖3C)。各組染色指數結果見表3，三組之間兩兩比較差異均有統計學意義(T＝21.00，P ＝ 0.002 ＜ 0.017)。

圖1 脊髓灰質前角HE染色(×200)。

圖2 脊髓灰質前角尼氏染色(×200)。

表2 脊髓灰質前角尼氏小體計數

圖3 脊髓灰質前角GFAP染色(×200)。

表3 脊髓灰質前角GFAP染色指數

3 討論

本實驗研究對象脊髓供血動脈比較單一，且相互間缺少充分的吻合支，尤其是腰段脊髓，以腰動脈供血為主，為夾閉腰動脈建立模型提供了理論基礎。研究對象體積較大，血管易于分離，可單純夾閉腰動脈，能避免夾閉腹主動脈后雙下肢缺血對實驗結果的影響，使誤差更小。模型建立后行為學和病理學方面的差異較為穩定，提示模型建立成功，所選研究對象滿足實驗條件。

SCII是一個復雜的、多種因素共同參與的病理生理學過程，其中細胞內Ca2+超載是引起神經損傷的重要一環，理論上抑制Ca2+內流可減輕神經損傷程度。尼莫地平是經典的第二代鈣離子通道阻滯劑之一，可作用于與鈣離子通道有關的血管受體[12]和神經元受體[13]，明顯降低細胞內鈣離子水平，達到抗血管痙攣和抗缺血作用，提高神經元的缺血耐受能力和功能的穩定性。

本實驗中，從表1可以看出，各觀察時間點假手術組和對照組、假手術組和尼莫地平組之間差異明顯。3 d時尼莫地平組Reuter評分較對照組低，差異有統計學意義，1 d、2 d時兩組差異無統計學意義，我們考慮原因為SCII最初階段再灌注損傷尚未達到一定程度，而隨著再灌注損傷的加重，尼莫地平對脊髓的保護作用才得以體現。圖1表明在治療3 d后，尼莫地平組脊髓灰質前角的整體結構紊亂、水腫、空泡樣變等損傷較對照組輕，且可見大量紅色神經元。紅色神經元是神經元損傷后處于早期階段的一種標志。因此，我們認為尼莫地平可能通過延緩SCII帶來的一系列序貫性損傷，使損傷維持在較早階段甚至可逆階段。圖2表明，尼莫地平組尼氏小體數量、結構均較對照組好轉，這是因為表示運動神經元功能活性的尼氏小體在發生中央性尼氏小體溶解的早期，病變過程是可逆的，具有代償意義，而給予的適當的尼莫地平干預措施使得部分損傷早期的尼氏小體基本恢復正常。尼氏小體計數之間的差異也表明治療有效(表2)。 星形膠質細胞(astrocyte，Ast)在神經系統疾病的病理生理過程及神經瘢痕修復中起重要作用。作為公認的Ast的特征性標記蛋白[14]，神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達能反映出神經細胞損傷程度，且兩者呈反比關系，即神經細胞損傷越重，GFAP表達量越多。如圖3所示，假手術組擬定區域未見明顯GFAP表達，脊髓無明顯損傷；尼莫地平組和對照組均見明顯GFAP表達，且尼莫地平組表達產物面積及染色程度較對照組低，間接證明尼莫地平組脊髓損傷較對照組輕，說明尼莫地平的治療減輕了脊髓損傷程度。

總之，通過本研究發現，尼莫地平作為經典的鈣離子通道阻滯劑，可以在神經行為學和組織病理學方面有效地降低脊髓缺血再灌注所帶來的一系列序貫性損傷，有一定的保護作用，但其臨床療效仍需在嚴密設計下進行臨床研究予以證實。

[1]Khalaj L，Peirovi H，Khodagholi F，et al.Acute 17β-estradiol pretreatment protects against abdo minal aortic occlusion induced spinal cord ischemic-reperfusion injury [J].Neurochemical research，2011，36(2)：268-280.

[2]孫延卿，陳雄生.脊髓缺血再灌注損傷的研究進展[J].脊柱外科雜志，2010，8(5)：311-315.

[3]Nehrt A，Rodgers R，Shapiro S，et al.The critical role of voltage-dependent calcium channel in axonal repair following mechanical trauma[J].Neuroscience，2007，146(4)：1504-1512.

[4]Verma D，Gupta YK，Parashar A，et al.Differential expression of L-and N-type voltage-sensitive calcium channels in thespinal cord of morphine+nimodipine treated rats[J].Brain research，2009，1249：128-134.

[5]Dai Y，Jordan LM.Tetrodotoxin-，dihydropyridine-，and riluzole-resistant persistent inward current：novel sodium channels in rodent spinal neurons[J].Journal of Neurophysiology，2011，106(3)：1322-1340.

[6]章凱，廖維宏，伍亞民，等.尼莫地平對大鼠脊髓缺血再灌流損傷的影響[J].中華實驗外科雜志，1996，13(3)：184.

[7]Kwun BD，Vacanti FX.Mild hypothermia protects against irreversible damage during prolonged spinal cord ischemia [J].Journal of Surgical Research，1995，59(6)：780-782.

[8]譚美云，郭杏，王遠輝.選擇性結扎節段動脈致局灶性脊髓缺血損傷動物模型的建立[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(24)：4407-4410.

[9]宋啟民，楊衛忠，陳春美.兔子脊髓缺血動物模型建立的解剖學基礎[J]. 中國神經精 神疾病雜志 ，2010，36(7)：429-431.

[10]Reuter DG，Tacker WA，Badylak SF，et al.Correlation of motor-evoked potential response to ischemic spinal cord damage[J].J Thorac cardiovasc surg，1992，104(2)：262-272.

[11]Taira Y，Marsaia M.Effect of proximal arterial perfusion pressure on function，spinal cord blood flow，and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the Rat[J].Stroke，1996，27(10)：1850-1858.

[12]Kronvall E，Undren P，Romner B，et al.Nimodipine in aneurysmal subarachnoid hemorrhage：a randomized study of intravenous or peroral ad ministration[J].J Neurosurg，2009，110(1)：58-63.

[13]Ouardouz M，Malek S，Coderre E，et al.Complex interplay between glutamate receptors and intracellular Ca2+stores during ischaemia in rat spinal cord white matter[J].J Physiol，2006，577(1)：191-204.

[14]Douglas LE，Lawrence FE.Glial fibrillary acidic protein：The intermediate filament protein of astrocytes[J].Advances in Neurobiology，2011，3(1)：455-501.