社區(qū)人群MTHFR基因多態(tài)性與大腦中動脈狹窄的相關(guān)研究☆

譚雙全 劉冰 蘇麗麗 付賢 黃海威 黃家星

近年來，在北美、歐洲、新加坡、香港、中國大陸等地的多項病例對照研究顯示MTHFR C677T突變是缺血性腦血管疾病的危險因素[1-4]。這些研究，多關(guān)注于MTHFR基因多態(tài)性與腦血管終末事件(缺血性腦卒中、癡呆等)的相關(guān)性，但到目前為止，其與顱內(nèi)動脈狹窄是否具有相關(guān)性還未見報道。顱內(nèi)動脈狹窄是全球范圍內(nèi)腦卒中的重要病因，尤其在中國和亞洲人群中更為突出[5]，為此，我們對廣東省某社區(qū)漢族人群作了一橫斷面調(diào)查，研究社區(qū)漢族人群中MTHFR基因型的分布特征，探討社區(qū)人群MTHFR C677T基因突變與大腦中動脈狹窄的相關(guān)性，以期為腦血管病的社區(qū)防治提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 在廣東省佛山市順德區(qū)容奇社區(qū)，以居委會為調(diào)查單位，整群抽取無心腦血管病史的當?shù)卦L的漢族成年居民1405例，入選個體在2個月內(nèi)到容奇醫(yī)院門診，由經(jīng)過專門培訓(xùn)的專職醫(yī)務(wù)人員填寫統(tǒng)一的調(diào)查表、記錄居民病史和體格檢查。共有1228例應(yīng)答，應(yīng)答率為87.4%，最終有效血樣1146例(有效率93.3%，年齡53(19)歲，其中男 379例，女 767例，男女各年齡組構(gòu)成比的差異無統(tǒng)計意義)。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查及生化指標檢測 問卷采集年齡、性別、既往史、煙酒嗜好史等資料，用國際標準法測量身高、體重、腰圍、臀圍和血壓。既往病史的確定以調(diào)查對象自述為準，但必須經(jīng)區(qū)(縣)級以上醫(yī)院診斷。晨起空腹抽取靜脈血，由Beckman CX5自動生化分析儀測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、血甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)值。

1.2.2 經(jīng)顱多普勒檢查 由2名經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的資深技術(shù)人員，采用德國EME公司的TC-2021型TCD診斷儀探查顱內(nèi)動脈。MCA狹窄的標準是：平均血流速度Vm≥80 cm／s，與附近或者對側(cè)同一動脈相比平均血流速度增高＞30%，可伴有雜音或湍流[6-7]。

1.2.3 基因型的鑒定 采用TIANGEN公司的試劑盒抽提基因組DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP)鑒定目標人群MTHFR 677位基因型。PCR的 上 游 引 物 Primer1：5-CAAAGGCCACCCCGA AGC-3′，下游引物 Primer2：5′-AGGACGGTGCGGT GAGAGTG-3′[4]；反應(yīng)條件：①94℃ 5 min； ②94℃1 min；③64℃ 30 s； ④72℃ 1 min；⑤返回第 ②步34循壞；⑥72℃5 min；⑦4℃ 保存。 取PCR產(chǎn)物7 μL 加 HinfⅠ(10 U／μL)內(nèi)切酶 1 μL，按標準配法配成 20 μL體系，37℃孵育 12 h，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)計量資料用 x±s描述、t檢驗分析，偏態(tài)資料用 M(QR)描述、用 Mann-Whitney U檢驗分析；計數(shù)資料用χ2檢驗分析；進一步用二分類非條件Logistic回歸探討MTHFR C677T基因突變是否為大腦中動脈狹窄的獨立預(yù)測因素。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因擴增結(jié)果和基因型分析 本PCR產(chǎn)物為245 bp，當MTHFR發(fā)生677C→T突變時，剛好產(chǎn)生一個HinfⅠ內(nèi)切酶位點。MTHFR 677野生型(C／C)245 bp；雜合型(T／C)245 bp、173 bp、72 bp；突變純合型(T／T)173 bp、72 bp(圖 1)。任選3種基因型的PCR產(chǎn)物各一個，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司純化并測序，測序結(jié)果用NCBIBLAST比對，確認為目的片段無誤。

1146例居民中 C／C 野生型 694例(60.6%)；T／C雜合型 391例(34.1%)；T／T純合突變型 61例(5.3%)研究對象基因型頻率和等位基因頻率的人群分布特點具有良好的均衡性。目標人群中MTHFR C677T突變基因型分布經(jīng)χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg平衡(χ2＝0.2088，P＝0.901)。與其他研究比較，MTHFR C677T突變存在種族和地域的差異(見表1)。

2.2 TCD檢測結(jié)果及其人群分布特點 1146名居民中有919名接受TCD檢測，其中719名順利檢測到大腦中動脈血流。按前述MCA狹窄的標準[6-7]，將 719 名分為 MCA 狹窄組(MCAS)92 例和 MCA非狹窄組(NMCAS)627名。 經(jīng)χ2檢驗MCA檢出樣本與總樣本人群分布特點具有良好的一致性(男女分布χ2＝0.571，P＝0.450，年齡構(gòu)成χ2＝6.173，P＝0.104)，同樣 MCA檢出樣本與總樣本MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率分布也具有較好的一致性(基因型頻率χ2＝ 0.148，P＝0.929，等位基因頻率χ2＝0.000，P＝0.994)。

2.3 MCA狹窄組與非狹窄組MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率分布比較 兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布見表2，兩組基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律(MCA狹窄組χ2＝0.122，P＝0.941，MCA 非狹窄組χ2＝0.40，P＝0.980)。經(jīng)χ2檢驗，MTHFR C677T基因型頻率分布兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝7.536，P＝0.023)，兩基因型聯(lián)合比較(T／C+T／T 與 C／C)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝4.602，P＝0.032，OR＝1.613，95%CI 1.039～2.502)。基因型兩兩比較中，T／T與 C／C 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝5.320，P＝0.021，OR ＝2.804，95%CI 1.243～6.329)，但 T／C與 C／C比較無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2＝2.590，P＝0.108)。MCA狹窄組的T等位基因頻率明顯高于非狹窄組(χ2＝6.828，P＝0.009，OR＝1.576，95%CI 1.118～2.222)。

2.4 危險因素分析及 Logistic回歸 按資料類型對臨床資料進行單因素分析(見表3)，結(jié)果性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、同型半胱氨酸、收縮壓在MCA狹窄與非狹窄組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將上述變量用Forward，LR法進行二分類非條件Logistic回歸分析(見表4)，結(jié)果顯示女性、年齡、收縮壓、糖尿病史、同型半胱氨酸、基因型是MCA狹窄的獨立危險因素，其中MTHFR 677T／T基因型與C／C相比，發(fā)生MCA狹窄的OR值為3.393(95%CI 1.230～9.357)。

圖1 MTHFR 677位點PCR產(chǎn)物HinfⅠ酶切電泳圖

表1 不同種群MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率分布

表2 MCA狹窄與非狹窄組MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率分布

表3 大腦中動脈狹窄相關(guān)危險因素的單因素分析

表4 MTHFR C677T突變與MCA狹窄的Logistic回歸分析

3 討論

1998 年 Schneider 等[21]和 Franco 等[22]分 別 對全世界多個不同個國家和地區(qū)的無關(guān)聯(lián)的個體或者人種，進行了MTHFR C677T基因突變頻率分析。他們一致認為C677T突變在不同人群中分布頻率是有差異的。為比較廣東社區(qū)漢族人群與其他人群C677T突變頻率的差異，我們在現(xiàn)有發(fā)表的文獻中選取了14份病例對照研究(對照組人數(shù)大于100，而且符合Hardy-Weinberg平衡定律)的對照組與之作了比較。在所有比較的人群中，目標人群與香港人群的在基因型頻率和等位基因頻率分布上保持了較好的一致性，這可能是因為香港與廣東毗鄰，原是廣東的一部分，兩地人群很多生活習俗相同，在遺傳背景上有較好的同質(zhì)性；目標人群在基因型頻率方面與蒙古族和印度人無明顯差異，但是等位基因頻率比蒙古族人要低(P＜0.05)、比印度人要高(P ＜ 0.05)；目標人群的 T／T純合突變型頻率和T等位基因頻率比北京漢族、河南林縣漢族、日本、愛爾蘭、意大利、瑞士、英國、猶太人、美國和加拿大人都要低。由此表明C677T基因突變的分布存在著種族和地域的差異。

多因素logistic回歸表明女性、年齡、收縮壓、糖尿病史、同型半胱氨酸、基因型是MCA狹窄的獨立危險因素，其中前5者和MCA狹窄的相關(guān)性與既往研究相一致[23-24]；本研究重點探討MTHFR C677T突變與MCA狹窄的關(guān)系，在不考慮其他因素影響的前提下，攜帶MTHFR 677T等位基因的個體發(fā)生MCA狹窄的風險是C等位基因的1.576倍、攜帶MTHFR 677T／T基因型的個體發(fā)生MCA狹窄的風險是C／C基因型的2.804倍；在校正性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、體重指數(shù)、腰臀比、收縮壓、舒張壓等可能混雜因素的潛在影響后，攜帶MTHFR 677T／T基因型的個體發(fā)生MCA狹窄的風險是C／C基因型的3.393倍。沒有發(fā)現(xiàn)T／C與C／C基因型之間的差別，由此說明MTHFR 677T／T基因型可能是MCA狹窄的遺傳易感基因。MTHFR是催化5、10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶；5-甲基四氫葉酸是人體內(nèi)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)甲基化轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸的甲基團供體，Hcy甲基化生成甲硫氨酸還需要維生素 B12的參與[4，25]。MTHFR C677T基因突變會降低MTHFR的穩(wěn)定性和活性，導(dǎo)致體內(nèi)5-甲基四氫葉酸生成減少，Hcy在人體內(nèi)蓄積，形成高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinaemia，HHcy)，這種情況在體內(nèi)葉酸和維生素B12缺乏時更為明顯[26]。大量的研究表明HHcy是缺血性心腦血管病的獨立危險因素[23，27]。雖然HHcy導(dǎo)致動脈硬化的機制還不明確，但根據(jù)現(xiàn)有資料我們可以推測Hcy水平升高可能是MTHFR C677T突變與MCA狹窄相關(guān)的中間環(huán)節(jié)。綜上所述，研究結(jié)果表明該社區(qū)漢族人群中存在MTHFR C677T基因突變；MTHFR C677T突變存在著種族和地域的差異。MTHFR C677T基因多態(tài)性與MCAS風險增加有關(guān)。這一結(jié)果可以為腦動脈狹窄形成之前的腦血管病的一級預(yù)防提供參考，但是目前我們的結(jié)果只是來源于一個社群人群在某一時點的橫斷面調(diào)查，還需要更多的流行病學(xué)資料和前瞻性研究來進一步論證。

[1]Ho GY，Eikelboom JW，Hankey GJ，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and homocysteine-lowering effect of vitamin therapy in Singaporean stroke patients[J].Stroke，2006，37(2)：456-460.

[2]Kim RJ，Becker RC. Association between factor V Leiden，prothrombin G20210A，and methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutations and events of the arterial circulatory system：a meta-analysis of published studies[J].Am Heart J，2003，146(6)：948-957.

[3]Li Z，Sun L，Zhang H，et al.Elevated plasma homocysteine was associated with hemorrhagic and ischemic stroke，but methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T polymorphism was a risk factor for thrombotic stroke： a Multicenter Case-Control Study in China[J].Stroke，2003，34(9)：2085-2090.

[4]Baum L，Wong KS，Ng HK，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene A222V polymorphism and risk of ischemic stroke[J].Clin Chem Lab Med，2004，42(12)：1370-1376.

[5]董強，黃家星，黃一寧，等.癥狀性動脈粥樣硬化性顱內(nèi)動脈狹窄中國專家共識[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2012，38(3)：129-145.

[6]Arenillas JF，Molina CA，Montaner J，et al.Progression and clinical recurrence of symptomatic middle cerebral artery stenosis： a long-term follow-up transcranial Doppler ultrasound study[J].Stroke，2001，32(12)：2898-2904.

[7]Demchuk AM，Christou I，Wein TH，et al.Specific transcranial Doppler flow findings related to the presence and site of arterial occlusion[J].Stroke，2000，31(1)：140-146.

[8]張燕，謝汝萍，陳大方，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與腦出血的相關(guān)研究[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2003，20(5)：417.

[9]肖艷群，蔣玲麗，陸青，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸水平與腦血管病的關(guān)系[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2006，21(3)：201-204.

[10]呼日勒，牛廣明，趙世剛，等.N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與蒙古族原發(fā)性高血壓病的關(guān)系[J].高血壓雜志，2006，14(4)：274-276.

[11]Stolzenberg-Solomon RZ，Qiao YL，Abnet CC，et al.Esophageal and gastric cardia cancer risk and folate-and vitamin B(12)-related polymorphisms in Linxian，China[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2003，12(11 Pt 1)：1222-1226.

[12]Wu Y，Tomon M，Sumino K.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and ischemic stroke：sex difference in Japanese[J].Kobe J Med Sci，2001，47(6)：255-262.

[13]Mukherjee M，Joshi S，Bagadi S，et al.A low prevalence of the C677T mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene in Asian Indians[J].Clin Genet，2002，61(2)：155-159.

[14]Harmon DL，Doyle RM，Meleady R，et al.Genetic analysis of the thermolabile variant of 5，10-methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for ischemic stroke[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19(2)：208-211.

[15]Motti C，Gnasso A，Bernardini S，et al.Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase.Correlation with homocysteine and other risk factors for vascular disease[J].Atherosclerosis，1998，139(2)：377-383.

[16]Todesco L，Angst C，Litynski P，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism，plasma homocysteine and age[J].Eur J Clin Invest，1999，29(12)：1003-1009.

[17]Markus HS，Ali N，Swaminathan R，et al.A common polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene，homocysteine，and ischemic cerebrovascular disease[J].Stroke，1997，28(9)：1739-1743.

[18]Friedman G，Goldschmidt N，F(xiàn)riedlander Y，et al.A common mutation A1298C in human methylenetetrahydrofolate reductase gene： association with plasma total homocysteine and folate concentrations[J].J Nutr，1999，129(9)：1656-1661.

[19]Skibola CF，Smith MT，Kane E，et al.Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene are associated with susceptibility to acute leukemia in adults[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(22)：12810-12815.

[20]Krajinovic M，Lamothe S，Labuda D，et al.Role of MTHFR genetic polymorphisms in the susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，2004，103(1)：252-257.

[21]Schneider JA，Rees DC，Liu YT，et al.Worldwide distribution of a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation[J].Am J Hum Genet，1998，62(5)：1258-1260.

[22]Franco RF，Araujo AG，Guerreiro JF，et al.Analysis of the 677 C→T mutation of the methylenetetrahydrofolate reductasegene in different ethnic groups[J].Thromb Haemost，1998，79(1)：119-121.

[23]Huang HW，Guo MH，Lin RJ，et al.Hyperhomocysteinemia is a risk factor of middle cerebral artery stenosis[J].J Neurol，2007，254(3)：364-367.

[24]蘇麗麗，黃海威，譚雙全，等.廣東省佛山市社區(qū)中老年人群無癥狀顱內(nèi)動脈狹窄的橫斷面研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2011，32(5)：469-472.

[25]Hankey GJ，Eikelboom JW，Ho WK，et al.Clinical usefulness of plasma homocysteine in vascular disease[J].Med J Aust，2004，181(6)：314-318.

[26]Ueland PM，Hustad S，Schneede J，et al.Biological and clinical implications of the MTHFR C677T polymorphism [J].Trends Pharmacol Sci，2001，22(4)：195-201.

[27]Homocysteine and risk of ischemic heart disease and stroke：a meta-analysis[J].JAMA，2002，288(16)：2015-2022.