PPARγ激動劑吡格列酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后JAK2／STAT3信號轉導通路的影響☆

廖小明 孫軍 唐永剛 齊立 余智 劉開祥

過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)是核受體超家族成員之一，參與體內多種生理和病理生理過程。近年來的研究表明，PPARγ與眾多組織器官的缺血性病理損傷關系密切，PPARγ激動劑預處理對心肺等的缺血再灌注損傷具有保護作用[1]。本實驗將應用 PPARγ激動劑吡格列酮對大腦中動脈缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion／reperfusion，MCAO／R)損傷模型大鼠進行治療，觀察PPARγ激動劑對局灶性腦缺血再灌注病理損傷的影響，并首次觀察PPARγ激動劑對 MCAO／R損傷大鼠腦內JAK2／STAT3信號轉導通路的影響，探討其腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年雄性SD大鼠80只，體重280～320 g，桂林醫學院實驗動物中心提供。隨機分為4組，每組20只，10只行HE染色，10只行Western-blotting檢測。術前12 h禁食，不禁水。①假手術組；②缺血再灌注模型組；③生理鹽水干預組：實驗前3 d及實驗前1 h生理鹽水灌胃，后行缺血再灌注處理；④吡格列酮干預組：實驗前3 d及實驗前1 h灌胃給藥(吡格列酮片15 mg／kg由成都宇陽高科有限公司提供)，后行缺血再灌注處理。

1.2 改良局灶性腦缺血再灌注模型制備 采用改良的Zea Longa等[2]左側頸內動脈線栓法，腹腔麻醉大鼠，頸部碘酊消毒，旁正中切口3～4 cm，分離左側頸部各動脈，靠遠端結扎頸外動脈(external carotid artery，ECA)及其分支，用蛙心夾夾閉頸內動脈(internal carotid artery，ICA)近心端及頸總動脈(common carotid artery，CCA)近心端，在 ECA 分叉遠端用1 mL注射器針頭刺一小口，將選取好的栓線自左ECA插入CCA分叉處，固定線栓，離斷ECA，調整方向，將線栓插入左ICA，松開蛙心夾，輕柔推進，稍感阻力即止，此時插入深度約為(18±2)mm，阻斷 2 h后，拔出栓線，行 CCA、ICA再灌注。大鼠清醒后出現神經功能缺失癥狀為模型成功的標志。

1.3 神經功能缺損評分 參照 Zea Longa[2]神經功能評分標準。無神經功能缺損征象為0分；病灶對側前肢不能完全伸直為1分；向癱瘓側旋轉為2分；向癱瘓側跌倒為3分；出現意識障礙為4分。神經功能缺損達1～3分者納入實驗。

1.4 組織切片制備及HE染色 再灌注22 h時，麻醉大鼠，經左心室向主動脈部位插管，待右心耳充盈后用剪刀將其剪開，分別用4℃生理鹽水100 mL、4%多聚甲醛磷酸緩沖液200灌洗，斷頭取腦，固定腦組織，石蠟包埋，行HE染色。

1.5 Western-blotting法檢測蛋白表達 Westernblotting檢測采用常規操作。大鼠于再灌注22 h時斷頭取腦，在冰上分離缺血側頂葉皮層大腦組織，勻漿，提取蛋白。蛋白定量后，每孔加樣量為50 μg蛋白。上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入 P-JAK2兔多克隆抗體(1∶100，由 SANTA CRUZ 公司提供)、P-STAT3 鼠單克隆抗體(1∶1000，由 EPITOMICS 公司提供)、及抗 β-actin(1∶500，由碧云天公司提供)抗體，4℃過夜。洗膜，加入二抗(山羊抗兔／兔抗小鼠IgG 1∶5000，由碧云天公司提供)孵育，發光，記錄結果。蛋白條帶進行相對密度掃描并分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0進行統計學處理，實驗數據均以(x±s)表示，采用單因素方差分析及q檢驗進行統計處理。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 PPARγ激動劑吡格列酮對缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響 假手術組大鼠神經功能正常，模型組、生理鹽水干預組大鼠表現出明顯神經功能缺損癥狀，而吡格列酮干預組大鼠神經功能缺損癥狀均獲不同程度改善。吡格列酮干預組與模型組及生理鹽水干預組比較差異具有統計學意義(P＝0.002，P＝0)，生理鹽水干預組與模型組相比差異無統計學意義(P＝0.686)(見表1)。

表1 大鼠的神經功能評分

2.2 吡格列酮對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側頂葉皮層(尾狀核平面)病理改變的影響 HE染色光鏡觀察：假手術組大鼠腦組織結構正常，腦血管內皮細胞及神經細胞結構完整，胞漿及胞核清晰。模型組與生理鹽水干預組則見大腦皮層細胞體積縮小，胞漿疏松，胞質濃縮，核固縮，染色質濃集于核膜附近，形成凋亡小體。吡格列酮干預組神經細胞變性壞死程度與模型組及生理鹽水干預組相比較輕(見圖1)。

2.3 吡格列酮對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側頂葉腦組織中P-JAK2、P-STAT3表達的影響Western-blotting法檢測 假手術組未見明顯PJAK2、P-STAT3蛋白的表達，模型組及生理鹽水干預組缺血再灌注區腦組織P-JAK2、P-STAT3蛋白的表達明顯增多，吡格列酮干預組P-JAK2、P-STAT3蛋白的表達明顯減少。吡格列酮干預組與模型組及生理鹽水干預組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，生理鹽水治療組與模型組相比無統計學差異(P ＝ 0.763，P ＝ 0.753)(見表2及圖 2)。

3 討論

缺血再灌注損傷是腦缺血后重要的病理生理過程，降低缺血再灌注損傷意義重大，研究發現多種藥物都對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[3]，PPARγ 激動劑就是其中一類，它能明顯減少腦缺血再灌注損傷后腦梗塞的體積，減輕神經功能缺損情況[4-5]。研究發現PPARγ激動劑可以通過上調缺血再灌注腦組織中PPARγmRNA和蛋白的表達，增強對缺血腦組織的保護作用[6]。本研究進一步證實了吡格列酮干預后可以明顯降低缺血再灌注大鼠的神經功能評分，能夠明顯減輕缺血再灌注后腦組織的病理損傷，起到腦保護作用。

圖1 A.假手術組大鼠頂葉皮層(200×)；B.模型組大鼠頂葉皮層(200×)；C.生理鹽水干預組大鼠頂葉皮層(200×)；D.吡格列酮干預組組大鼠頂葉皮層(200×)

表2 大鼠腦組織P-JAK2、P-STAT3蛋白的表達

圖2-1 大鼠腦組織P-JAK2蛋白表達

圖2-2 大鼠腦組織P-STAT3蛋白表達

JAK2／STAT3信號轉導通路在心、腦缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用[7-8]。PPARγ激動劑能抑制多種炎性因子在巨噬細胞中的表達，而且也能阻礙STATs等一些促炎癥轉錄因子的誘導作用[9]。研究發現在體外培養的有活性的星形膠質細胞和小神經膠質細胞中，羅格列酮能抑制STAT1、STAT3、JAK1、JAK2 的磷酸化[10]。 在大鼠腦缺血后行側腦室注射JAK2抑制劑(AG490)，起到了改善神經功能，縮小腦梗死面積，減少了神經細胞的凋亡的作用，同時抑制了缺血區P-JAK2、P-STAT3的表達[11]。以上研究表明PPARγ激動劑對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與神經細胞內一些信號轉導通路有關。本研究證實了PPARγ激動劑吡格列酮可以下調局灶性腦缺血再灌注后大鼠缺血再灌注區P-JAK2、P-STAT3的表達，降低缺血再灌注損傷大鼠神經功能評分，減輕腦組織病理損傷，推測PPARγ激動劑吡格列酮的腦保護作用可能與其下調神經細胞內JAK2／STAT3信號轉導通路的表達有關。

針對轉錄因子的治療目前仍處于起步階段。一些可以防止與炎癥等有關的轉錄因子啟動的小分子由于副作用少，臨床應用的前景十分廣闊。吡格列酮并不影響無糖尿病動物的血糖[12]，但有可能會起到腦保護的作用，因此，用吡格列酮治療無糖尿病的腦梗死患者的臨床前景廣闊。當然，其臨床遠期效果及其詳細機制等相關研究還需要進一步深入進行。

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