假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的診治與生存質(zhì)量分析

胡君 蔣莉 袁召建 朱進(jìn) 孔敏 葉園珍

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne／Becker muscular dystrophy，DMD／BMD)是一種常見(jiàn)的致死性的X連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉疾病，由位于X染色體上Xp21.2區(qū)域的Dystrophin基因缺陷引起Dystrophin 蛋白缺乏所致[1]，發(fā)病率分別為 1／3500 和 1／12000活產(chǎn)男嬰[2]。目前尚缺乏有效的治愈手段，以糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)為主的綜合治療措施可延長(zhǎng)DMD患兒步行能力，增強(qiáng)心肺功能，延長(zhǎng)生命，提高生存質(zhì)量[3-6]。為了解西南地區(qū) DMD／BMD患兒的診治現(xiàn)狀及生存質(zhì)量，提高診療水平，本文初步總結(jié)并分析2009年12月至2011年12月我院DMD／BMD的診治及生存質(zhì)量情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年12月至2011年12月我院疑診DMD／BMD病例294例，男266例，女28例；年齡 0.08～17歲，平均(5.85± 3.77)歲。來(lái)源：重慶市164例、四川省89例、貴州省28例、云南省 9例及西藏自治區(qū) 4例。疑診標(biāo)準(zhǔn)[5]：1)無(wú)陽(yáng)性家族史：①臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育，如走路時(shí)間延遲等；行走緩慢、呈鴨步，頻繁摔跤、爬起困難、Gowers征陽(yáng)性，跑步及爬樓梯困難，可有足尖走路現(xiàn)象；可見(jiàn)翼狀肩、腓腸肌肥大等。②無(wú)法解釋的肌酶顯著增高。③無(wú)法解釋的血清轉(zhuǎn)氨酶異常增高。2)有陽(yáng)性家族史：可疑肌力、肌肉功能異常，肌酶增高可能不明顯。3)除外多發(fā)性肌炎和脊肌萎縮癥、重癥肌無(wú)力等其他肌肉疾病。患兒及其家屬同意參與研究并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基因檢測(cè) 多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiple polymerase chain reaction，mPCR)+短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，STR)多態(tài)性連鎖分析法[7-9]：①DNA 制備 取外周血 3～5 mL EDTA 抗凝，用飽和鹽析法提取外周血DNA。②mPCR法擴(kuò)增 DNA 11 對(duì) 外 顯 子(4、8、12、17、19、44、45、48、49、50、51) 及 6 對(duì) STR(5CA、44CA、45CA、49CA、50CA、3CA)序列由上海生工公司設(shè)計(jì)、合成，分成2組進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系含DNA 4 μL，dNTP 0.5 μL，每條引物各 1 μL，Taq polymerase 0.2 μL，10 × buffer 2.5 μL，加去離子雙蒸水至 25 μL，在PE-PCR儀(9600)上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 20 s，53／55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。③判斷標(biāo)準(zhǔn)：取15 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE緩沖液中電泳，以正常男性模板擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照，擴(kuò)增帶都存在為正常。缺失任何一條帶，經(jīng)重復(fù)擴(kuò)增后結(jié)果相同，診斷為基因缺失型DMD／BMD。

1.2.2 肌肉病理檢測(cè) 基因檢測(cè)陰性患兒，隨機(jī)抽取17例行腓腸肌開(kāi)放性活檢，所取組織用10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水包埋，石蠟切片，行HE染色。診斷標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下可見(jiàn)：①肌萎縮、壞死、再生共存；②纖維脂肪組織增生；③肌肥大、核內(nèi)移；④少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2.3 生存質(zhì)量評(píng)估[10-11]兒童生存質(zhì)量源量表PedsQLTM 3.0神經(jīng)肌肉疾病模塊(the Pediatric Quality of Life InventoryTM3.0 Neuromuscular Module，PedsQLTM 3.0 NMM)由 Iliana PETKOVA 教授授權(quán)提供。遵循“翻譯-逆向翻譯-文化調(diào)試-預(yù)試驗(yàn)-現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)”量表引進(jìn)程序，翻譯修訂而成。該量表共有25個(gè)問(wèn)題、3個(gè)維度，分別是：疾病(17個(gè)問(wèn)題)、交流(3 個(gè)問(wèn)題)、家庭(5 個(gè)問(wèn)題)；包含父母代評(píng)量表和兒童自評(píng)量表兩部分。每個(gè)問(wèn)題的回答選項(xiàng)分 0、1、2、3、4五個(gè)等級(jí)，其含義分別是：0(100 分)表示“從來(lái)沒(méi)有”，1(75 分)表示“幾乎沒(méi)有”，2(50 分)表示“有時(shí)有”，3(25 分)表示“經(jīng)常有”，4(0分)表示“一直有”。分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明生存質(zhì)量越好。測(cè)試：隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取39例確診患兒及其家長(zhǎng)，DMD 37例，BMD 2例。采用PedsQLTM 3.0 NMM中文版以現(xiàn)場(chǎng)、電話(huà)或書(shū)信的方式行生存質(zhì)量調(diào)查。

1.2.4 DMD ／BMD 患兒的治療情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行百分率和秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻率(n)、百分?jǐn)?shù)(%)等進(jìn)行描述。非正態(tài)分布的各維度得分用中位數(shù)與最大值、最小值描述。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè) 294例疑診病例經(jīng)mPCR+STR序列檢查，檢出96例外顯子／STR缺失，陽(yáng)性率32.65%，男96例，女0例。外顯子48和50缺失率最高，為 47.92%(46／96)、48.96%(47／96)；其次是外顯子 49 和 51，為 37.5%(36／96)、36.46%(35／96)。缺失外顯子位于中央缺失熱區(qū)(44～51外顯子)的檢出率為 85.42%(82／96)；位于 5’端缺失熱區(qū)(2～20外顯子) 的檢出率為19.79%(19／96)。STR49CA和50CA缺失率最高，為 59.26%(48／81)、51.85%(42／81)。 見(jiàn)表1。

2.2 肌肉病理檢測(cè) 17例(男 15例，女 2例)基因檢測(cè)陰性病例行腓腸肌活檢。陽(yáng)性率為82.35%(14／17)，男 13例，女 1例。 光鏡下，肌纖維有不同程度數(shù)目減少、變性、壞死，肌纖維粗細(xì)不均，橫紋消失或萎縮，胞核向中心移位，間質(zhì)纖維結(jié)締組織及脂肪組織增生(如圖1)。2例見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，占14.29%。

2.3 診斷 根據(jù)臨床資料、基因檢測(cè)、肌肉病理檢測(cè)綜合評(píng)估，294例疑診病例中，110例確診為DMD／BMD，DMD101例，BMD9例。

表1 96例DMD／BMD患兒基因缺失結(jié)果

圖1 可見(jiàn)萎縮、肥大及壞死肌纖維×200

2.4 生存質(zhì)量評(píng)估 PedsQLTM 3.0 NMM中文版對(duì)39例DMD／BMD患兒及其家屬問(wèn)卷結(jié)果顯示，量表的缺失率為0.31%、0.64%，均 ＜1%。克倫巴赫系數(shù) α(Cronbach’s α)介于 0.74～0.88，均＞0.7；評(píng)定者間的信度(intraclass correlation coefficient，ICC)介于 0.74～0.86，均 ＞0.6。 各條目與所屬維度的Spearman相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of Spearman，rs)分別為 0.42～0.88和 0.39～0.84，均呈中、高度相關(guān)，而與其他維度的相關(guān)較弱。相對(duì)擬合指數(shù)(Comparative fit index，CFI) 分別為0.94、0.93，均 ＞ 0.9。提示 PedsQLTM 3.0 NMM 中文版具有較好的信度和效度。

根據(jù)Gowers征陽(yáng)性與否將 39例 DMD／BMD患兒分為兩組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，病情越重，PedsQLTM3.0 NMM中文版疾病維度評(píng)分越低，差異有顯著性(P＜0.05)。而交流、家庭維度評(píng)分普遍較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表2)。

2.5 治療情況 101例確診DMD患兒，綜合考慮其年齡、肌力、肌肉功能、副反應(yīng)的危險(xiǎn)因素等，以及疾病所處階段(進(jìn)步期、平臺(tái)期、惡化期)，同時(shí)征得患兒及家屬同意而決定使用GC[5]。18例(17.82%)予口服潑尼松 0.75 mg／(kg·d)治療，并積極行康復(fù)治療[3-6]；21 例(20.79%)予不同劑量的潑尼松治療。療效判斷：肌力、肌肉功能、心肺功能、生存質(zhì)量等。大部分未予治療，觀察隨訪(fǎng)中。

3 討論

DMD／BMD是X連鎖、隱性遺傳的神經(jīng)肌肉疾病，由 Dystrophin基因突變引起。有報(bào)道[12]：約1／3系新突變引起；外顯子缺失突變占55%～65%，重復(fù)突變占5%～15%，點(diǎn)突變占35%。Dystrophin基因的缺失存在兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，即5端缺失熱區(qū)，位于2～20號(hào)外顯子區(qū)，約占30%；中央缺失熱區(qū)，位于44～51號(hào)外顯子區(qū)，約占70%。Dystrophin基因缺失突變存在“熱區(qū)”是mPCR法檢測(cè)Dystrophin基因的遺傳學(xué)基礎(chǔ)[12]。STR多態(tài)性連鎖分析可較好地檢出DMD／BMD攜帶者或雜合子；而且這些位點(diǎn)雜合率高，重復(fù)次數(shù)多，其多態(tài)性也高，非常適合基因連鎖分析[9]。本研究應(yīng)用mPCR+STR多態(tài)性連鎖分析法，對(duì)294例疑診病例進(jìn)行檢測(cè)，檢出96例外顯子／STR缺失，陽(yáng)性率32.65%。外顯子48和50缺失率最高，為47.92%、48.96%；其次是外顯子49和51，為37.5%、36.46%。缺失外顯子位于中央缺失熱區(qū)(44-51外顯子)的檢出率為 85.42%；位于5’端缺失熱區(qū)(2-20外顯子)的檢出率為19.79%。STR49CA和50CA缺失率最高，為59.26%、51.85%，與國(guó)內(nèi)的多數(shù)研究結(jié)果一致[14-19]。提示mPCR+STR多態(tài)性連鎖分析既可直接檢測(cè)出Dystrophin基因缺失，又能通過(guò)STR多態(tài)分析驗(yàn)證缺失診斷的結(jié)果，從而提高基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

表2 39例DMD／BMD患兒PedsQLTM 3.0 NMM 評(píng)估結(jié)果

肌肉活檢是DMD／BMD確診的重要方法。光鏡下具有特征性的變化，表現(xiàn)為肌纖維不同程度數(shù)目減少、變性、壞死，肌纖維粗細(xì)不均，橫紋消失或萎縮，胞核向中心移位，間質(zhì)纖維結(jié)締組織及脂肪組織增生；可有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究中，17例基因檢測(cè)陰性病例行腓腸肌活檢，陽(yáng)性率為82.35%(14／17)，提示肌肉活檢是 DMD／BMD 確診手段的良好補(bǔ)充[20-24]。

隨著健康相關(guān)生存質(zhì)量的廣泛使用，生存質(zhì)量也開(kāi)始應(yīng)用于兒童神經(jīng)肌肉疾病的病情、療效及臨床隨訪(fǎng)的評(píng)價(jià)[25-26]。PedsQLTM 3.0 NMM國(guó)外已證實(shí)具有良好的信度和效度[10，11]。本研究首次將PedsQLTM 3.0 NMM引進(jìn)國(guó)內(nèi)，遵循 “翻譯-逆向翻譯-文化調(diào)試-預(yù)試驗(yàn)-現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)”等程序，形成PedsQLTM3.0 NMM中文版，并對(duì)39例DMD／BMD患兒及其家屬問(wèn)卷。結(jié)果顯示，量表的缺失率＜1%；Cronbach’s α ＞ 0.7，ICC ＞ 0.6； 各條目與所屬維度的rs呈中、高度相關(guān)，CFI＞0.9，提示PedsQLTM 3.0 NMM中文版具有較好的可行性、信度和效度，可應(yīng)用于我國(guó)DMD／BMD患兒生存質(zhì)量的評(píng)價(jià)。通過(guò)秩和檢驗(yàn)比較不同病情DMD／BMD患兒在PedsQLTM 3.0 NMM中文版各維度得分的差別。結(jié)果顯示，病情越重，疾病維度評(píng)分越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而交流、家庭維度評(píng)分普遍較低。提示病情輕重是影響DMD／BMD患兒生存質(zhì)量的主要因素；他們普遍缺乏良好的交流，家庭經(jīng)濟(jì)條件普遍較差。這需要臨床醫(yī)師、社會(huì)的共同努力以改變這一局面。

有報(bào)道，GC治療可延長(zhǎng)DMD患兒步行能力2～5年，增強(qiáng)心肺功能，延長(zhǎng)壽命，提高生存質(zhì)量。因此，國(guó)際上推薦使用GC治療DMD[3-6]。初始給藥時(shí)間應(yīng)綜合考慮患兒的年齡、肌力、肌肉功能、副反應(yīng)的危險(xiǎn)因素等，并參照疾病所處階段(進(jìn)步期、平臺(tái)期、惡化期)而決定。推薦初始劑量：潑尼松 0.75 mg／(kg·d)或地夫考特 0.9 mg／(kg·d)。 一旦開(kāi)始給藥，就應(yīng)密切監(jiān)測(cè)副反應(yīng)。副反應(yīng)可耐受時(shí)，應(yīng)維持常規(guī)推薦給藥；否則應(yīng)減量或調(diào)整治療方案，必要時(shí)停藥[3-6]。本研究中，18例DMD患兒予潑尼松 0.75 mg／(kg·d)治療，并積極行康復(fù)治療；21例予不同劑量的潑尼松治療，大部分患兒未予治療。提示目前國(guó)內(nèi)對(duì)DMD治療的認(rèn)識(shí)不足，大部分臨床醫(yī)師及患兒家屬對(duì)GC的使用持遲疑態(tài)度，影響了DMD／BMD患兒的生存質(zhì)量。因此，制定適合我國(guó)國(guó)情的DMD／BMD診治指南，并加以推廣應(yīng)用，以改善DMD／BMD患兒的生存質(zhì)量，顯得尤為迫切。

綜上所述，西南地區(qū)DMD／BMD患兒并非罕見(jiàn)，應(yīng)用mPCR+STR多態(tài)性連鎖分析可提高基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但陽(yáng)性率不高；肌肉活檢是確診手段的良好補(bǔ)充。病情輕重是影響DMD／BMD患兒生存質(zhì)量的主要因素；他們普遍缺乏良好的交流，家庭經(jīng)濟(jì)條件普遍較差。目前臨床醫(yī)師及患兒家屬對(duì)DMD／BMD的診治認(rèn)識(shí)不足，制定適合我國(guó)國(guó)情的DMD／BMD診治指南，并加以推廣應(yīng)用，顯得尤為迫切。

致謝 衷心感謝Iliana PETKOVA教授免費(fèi)為本研究提供源量表，使研究得以順利進(jìn)行。另外感謝重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的鄒琳、覃佳強(qiáng)、李梅、洪思琪、李秀娟、鐘敏、胡越、郭藝、程莉等老師的幫助與支持。

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