地塞米松、FK－506和CX－659s對(duì)TARC產(chǎn)生的調(diào)控作用研究＊

于 彬 ，方素萍 ，劉 翔 ，宋 坪 ，董茂盛

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院國(guó)際醫(yī)療部，北京 100053;2.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院肝膽胃腸研究所，北京 100088)

趨化因子是一組由70～90個(gè)氨基酸組成的小分子量蛋白質(zhì)，在免疫及炎性反應(yīng)過(guò)程中對(duì)白細(xì)胞的正向趨化和浸潤(rùn)起到重要作用[1]。胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(TARC/CCL17)基因位于人第16條染色體，歸屬于β趨化因子，簡(jiǎn)稱為CC趨化因子，其N(xiāo)末端有2個(gè)連續(xù)排列的絲氨酸。TARC可與CD4+CD45RO+記憶T細(xì)胞的一部分——Th2細(xì)胞表達(dá)的CCR4受體結(jié)合，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞向炎癥部位趨化。樹(shù)突狀細(xì)胞[2]、角質(zhì)形成細(xì)胞[3]，成纖維細(xì)胞[4]等均可產(chǎn)生TARC。眾所周知，異位性皮炎等過(guò)敏性皮膚疾病的病變部位存在Th2細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，產(chǎn)生TARC等趨化因子，誘導(dǎo)CCR4介導(dǎo)的Th2細(xì)胞向炎癥部位浸潤(rùn)[5]。臨床常應(yīng)用地塞米松、他克莫司(FK－506)[6]和CX－659s[7]治療異位性皮炎等過(guò)敏性皮膚疾病，抑制皮膚局部炎性反應(yīng)，抑制外周單核細(xì)胞TARC的表達(dá)。但是它們對(duì)皮膚的兩種主要結(jié)構(gòu)性細(xì)胞——皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制尚不明了。本試驗(yàn)通過(guò)體外試驗(yàn)研究這幾種臨床常用藥物對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生TARC的調(diào)控作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥

TARC ELISA kit(R＆D公司);白細(xì)胞介素4(IL－4)、干擾素γ(IFN－γ)均為Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)為200－04;腫瘤壞死因子α(TNF－α)為 PeproTech公司產(chǎn)品，批號(hào)為 300－01A);TARC(R＆D公司，批號(hào)為277131);地塞米松(Sigma公司，批號(hào)為D1756);FK－506和CX－659s(日本藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社、日本興和株式會(huì)社，批號(hào)為D73003)。地塞米松、FK－506和CX－659s分別用丙酮、二甲基亞砜稀釋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人角質(zhì)形成細(xì)胞株 HaCaT 細(xì)胞，由 Dr.N.E.Fusenig，DKFZ，Heidelberg轉(zhuǎn)讓;人成纖維細(xì)胞NG1RGB細(xì)胞從日本理化研究所購(gòu)入，由協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社購(gòu)買(mǎi)。HaCaT細(xì)胞及EL4細(xì)胞、NG1RGB細(xì)胞分別在含10%滅活牛胎兒血清、青霉素(100 U/mL)、紅霉素(100 g/mL)的 DMEM、RITC80－7和 RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2，37℃狀態(tài)下培養(yǎng)。HaCaT細(xì)胞和NG1RGB細(xì)胞分別以4×105，2×106個(gè)/mL濃度播種在24、6孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，更換全部培養(yǎng)液。HaCaT細(xì)胞中加入地塞米松(10－9～10－5mol/L)、FK－506(10－12～10－5mol/L)或 CX－659s(10－6～10－2mol/L)，加入 IFN－γ(100 ng/mL)刺激，培養(yǎng) 48 h，取上清，15 000 r/min離心3 min，－80℃凍結(jié)保存，直至ELISA法檢測(cè)TARC蛋白質(zhì)濃度。NG1RGB 細(xì)胞中加入地塞米松(10－9～10－5mol/L)、FK －506(10－9～10－5mol/L)或 CX －659s(10－6～10－2mol/L)，加入IL－4(10 ng/mL)、TNF－α(50 ng/mL)和/或 IFN－γ(100 ng/mL)刺激，培養(yǎng)48 h，取上清，余同HaCaT細(xì)胞操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用藥前后及組間配對(duì)資料應(yīng)用 t檢驗(yàn)，療效用 χ2檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生TARC的調(diào)控作用

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)上清中產(chǎn)生117.01 pg/mL的TARC，10－9～10－5mol/L 的地塞米松表現(xiàn)出明顯抑制作用，而FK506和CX－659s未見(jiàn)此作用(圖1)。進(jìn)一步用IFN－γ刺激HaCaT細(xì)胞，促使其產(chǎn)生TARC，3種藥物的作用濃度分別為10－12～10－6mol/L(地塞米松)，10－12～10－6mol/mL(FK －506)和 10－6～10－2mol/L(CX －659s)，見(jiàn)圖 2。

IFN－γ刺激下，HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生TARC水平明顯增加，與空白對(duì)照組相比，P＜0.001;各種濃度的地塞米松作用效果雖然沒(méi)有達(dá)到空白對(duì)照組水平，但I(xiàn)FN－γ刺激組均顯示出抑制效果(＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001);各種濃度的 FK －506 作用效果雖然沒(méi)有達(dá)到空白對(duì)照組水平，但I(xiàn)FN－γ刺激組顯示出抑制效果(＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001);各種濃度的 CX －659s未見(jiàn)抑制效果，雖然10－2mol/L濃度作用下，TRAC產(chǎn)生明顯減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 對(duì)NG1RGB細(xì)胞產(chǎn)生TARC的影響

NG1RGB細(xì)胞在 IL－4，TNF－α，IFN－γ作用下產(chǎn)生 TARC。本試驗(yàn)證明，地塞米松在10－7mol/L濃度下表示輕度抑制作用(＊P ＜0.05);FK506 在 10－9～10－5mol/L 濃度未見(jiàn)抑制作用;CX－659s在 10－5～10－2mol/L濃度時(shí)表現(xiàn)出抑制作用，隨濃度增高，抑制作用相應(yīng)增強(qiáng)。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖1 對(duì)HaCaT細(xì)胞TARC表達(dá)的影響

圖2 IFN－γ刺激下，3種藥物對(duì)HaCaT細(xì)胞TARC表達(dá)的影響

圖3 IL－4，TNF－α，IFN－γ刺激下，3種藥物對(duì) NG1RGB細(xì)胞TARC表達(dá)的影響

本試驗(yàn)的目的在于研究3種免疫抑制劑抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的TARC表達(dá)的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，這些免疫抑制藥物能明顯地抑制TARC的表達(dá)，調(diào)節(jié)持續(xù)進(jìn)行的免疫炎性反應(yīng)。這些免疫抑制藥物通過(guò)皮膚的兩大結(jié)構(gòu)性成分，即角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，分別在不同條件下抑制TARC表達(dá)。筆者認(rèn)為，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均可以誘導(dǎo)CCR4+T細(xì)胞趨向炎癥部位，從而調(diào)節(jié)皮膚局部病理過(guò)程中的免疫炎性反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)上清中產(chǎn)生117.01 pg/mL的TARC蛋白;IFN－γ刺激HaCaT細(xì)胞，分別產(chǎn)生 957.25，1 001.5，96.31 pg/mL，前兩組數(shù)據(jù)明顯高于無(wú)刺激組(P＜0.001);IL－4，TNF－α，IFN－γ 作用 NG1RGB 細(xì)胞，產(chǎn)生TARC 分別為 856.28，420.34 和 706.07 pg/mL，水平明顯高于無(wú)刺激的細(xì)胞[4]。ELISA數(shù)據(jù)表明，各種濃度地塞米松和FK－506可不同程度地抑制HaCaT細(xì)胞中的TARC表達(dá)(P＜0.01或 P＜0.001);同樣，CX－659s可抑制NG1RGB細(xì)胞中TARC蛋白質(zhì)水平的表達(dá)(P＜0.01或 P＜0.001)，且具有濃度依賴性;地塞米松除在10－7mol/L濃度下表現(xiàn)出輕度抑制作用外，其他濃度和各濃度FK－506未見(jiàn)抑制效果。

已有研究表明，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在IL－4，TNF－α，IFN－γ刺激下對(duì)TARC表達(dá)的影響，不論蛋白質(zhì)，還是mRNA水平均得到一致結(jié)果[4]。本試驗(yàn)表明，3種免疫抑制劑分別在不同狀態(tài)下抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的TARC表達(dá)，而這些細(xì)胞在不同病理?xiàng)l件下所產(chǎn)生的TARC，已經(jīng)有試驗(yàn)報(bào)道[8－9]。

免疫抑制藥物臨床治療效果顯著，常常作為治療異位性皮炎等過(guò)敏性皮膚疾病的一線藥物。地塞米松通過(guò)含NF－AT轉(zhuǎn)錄區(qū)的RE－Ⅱ區(qū)域抑制白細(xì)胞介素5(IL－5)的表達(dá)[10]，有試驗(yàn)證明地塞米松通過(guò)NF－B活性調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞的分化與成熟。他克莫司受體結(jié)合蛋白(PEP－1－FK506BP)通過(guò)抑制異位性皮炎小鼠NF－B和MAPK活性，抑制細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，提示FK－506有可能為治療異位性皮炎的有效藥物[11]。CX－659s對(duì)HaCaT細(xì)胞TARC的抑制作用，是通過(guò)NF－B和STAT1的活性化起作用[12]。筆者認(rèn)為，免疫抑制藥物的抑制作用，F(xiàn)K－506和CX－659s通過(guò)抑制NF－B的DNA結(jié)合活性，從而抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的TARC表達(dá)。

由上可知，3種免疫抑制劑作用于角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，對(duì)TARC表達(dá)的調(diào)控作用，能夠抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的TARC蛋白質(zhì)表達(dá)。角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞調(diào)控TARC啟動(dòng)子活性的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]BaggioliniM.Chemokine and leukocyte traffic[J].Nature，1998，392(6676):565－568.

[2]Imai T，Nagira M，Takagi S，et al.Selective recruitment of CCR4 － bearing Th2cells toward antigen－presenting cells by the CC chemokine thymus and activation－regulated chemokine and macrophage－derived chemokine[J].Int Immunol，1999，11(1):81 － 88.

[3]Vestergaard C，Yoneyama H，Murai M，et al.Overproduction of Th2 CC chemokines TARC and MDC in the skin of the NC/Nga mouse correlates with exacerbation of atopic dermatitis skin[J].J Invest Dermatol，2000，115:640－646.

[4]Yu B，Koga T，Urabe K，et al.Differential regulation of thymus－ and activation－regulated chemokine induced by IL－4，IL－13，TNF－alpha and IFN － gamma in human keratinocyte and fibroblast[J].J Dermatol Sci，2002，30(1):29 －36.

[5]Kaplan AP.Chemokines，chemokine receptors and allergy[J].Int Arch Allergy Immunol，2001，124(4):423 － 31.

[6]黃小玲，賴永琿，林渡娣，等.糖皮質(zhì)激素與他克莫司軟膏治療成人特應(yīng)性皮炎的不良反應(yīng)對(duì)比分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011(6):104－105.

[7]Kido M，Takeuchi S，Esaki H，et al.Scratching behavior does not necessarily correlate with epidermal nerve fiber sprouting or inflammatory cell infiltration[J].J Dermatol Sci，2010，58:130 － 135.

[8]Leung DYM.Atopic dermatitis:new insights and opportunities for therapeutic intervention[J].J Allergy Clin Immunol，2000，105:860 － 876.

[9]Grewe M，Walter S，Gyufko K，et al.Analysis of the cytokine pattern expressed in situ in inhalant allergen patch test reactions of atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol，1995，105:407 － 410.

[10]Quan A，McCall MN，Sewell WA.Dexamethasone inhibits the binding of nuclear factors to the IL －5 promoter in human CD4+T cells[J].J Allergy Clin Immunol，2001，108(3):340 － 348.

[11]Kim SY，Sohn EJ，Kim DW，et al.Transduced PEP －1 －FK506BP ameliorates atopic dermatitis in NC/Nga mice[J].J Invest Dermatol，2011，131(7):1 477－1 485.

[12]Kwon DJ，Bae YS，Ju SM，et al.Casuarinin suppresses TARC/CCL17 and MDC/CCL22 production via blockade of NF－κB and STAT1 activation in HaCaT cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，417(4):1 254－1 259.