響應面法優化紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝

李文聰，楊仁明，強 偉，索有瑞，丁晨旭*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國科學院研究生院，北京 100049

紅花(Carthamus tinctorius L)菊科屬植物，是一種藥、染料、油、飼料兼用的經濟作物［1］。紅花籽，中藥習稱“白平子”，是紅花(Carthamus tinctorius L)的種子［1］。紅花籽粕是紅花籽提取油后的廢棄物，國內多用作廉價的肥料和飼料，對其中的化學成分研究較少。近年來，國外對紅花籽粕中的一些微量成分進行了研究，發現紅花籽粕中的5-羥色胺衍生物具有極強的抗氧化性和清除自由基活性［2］，可以調節人體內免疫反應，抑制腫瘤［3］、保護人體中的NK細胞免受程序性死亡［4］、強烈抑制黑色素生成等活性［5］。紅花籽粕中的N-阿魏酰5-羥色胺和N-(p-香豆酰)5-羥色胺具有保護心臟的功能，可以促進心肌運動，預防心肌機能發生障礙［6］。有的研究還表明，N-(p-香豆酰)5-羥色胺可以促進成纖維細胞增殖［7］，并且將會是一種很好的抗炎藥物［8］，對促進人類的健康有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花籽粕購自新疆;5-羥色胺硫酸肌酐標準品(純度99%);甲醇、乙醇和正己烷(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

優普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國Acculab公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;EYELA N-1100型旋蒸蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司;UV-759紫外-可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 5-羥色胺衍生物的提取方法

準確稱取過篩后的紅花籽粕5.00 g，加入不同的有機溶劑回流提取，提取液減壓抽濾，用旋轉蒸發儀蒸干，再用體積分數80%甲醇溶解，用正己烷萃取，取80%甲醇相，用旋轉蒸發儀蒸發，用甲醇溶解測定5-羥色胺衍生物含量。

具體的操作流程:紅花籽粕(原料)→過篩→紅花籽粕粉末→回流提取→減壓抽濾→濾液→蒸干→80%甲醇溶解→正己烷萃取→分液(80%甲醇相)→蒸干→甲醇溶解→5-羥色胺衍生物含量測定。

1.4 標準曲線的制作和5-羥色胺衍生物含量測定［8］

精確稱取5-羥色胺硫酸肌酐標準品0.1 g，0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL。精密吸取1 g/L的5-羥色胺硫酸肌酐溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容。用0.1 mol/L鹽酸做空白，310 nm波長處測5個樣品的吸光度(A)，以5-羥色胺衍生物濃度(C，g/L)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法計算得到回歸方程 A=3.1802C+0.0222(R2=0.999)。

5-羥色胺衍生物提取得率/%=(紅花籽粕5-羥色胺衍生物質量/紅花籽粕質量)×100%

1.5 單因素實驗設計

1.5.1 提取溶劑對提取得率的影響

準確稱取5.00 g粉碎度為32目的紅花籽粕粉末5份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，液料比20∶1(mL/g)，分別以70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑，80℃條件下回流提取2 h。

1.5.2 原料粒度對提取得率的影響

選取12、20、32、40和60目的紅花籽粕進行研究。其他的回流提取條件:無水乙醇為提取溶劑、回流溫度為80℃、回流提取時間為2 h、液料比為20∶1，測定提取得率。

1.5.3 提取時間對提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無水乙醇、原料粒度32目、液料比為20∶1、提取溫度為80℃。提取時間選取0.5、1、1.5、2、2.5、3，考察其對提取得率的影響。

1.5.4 提取溫度對提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無水乙醇、原料粒度32目、液料比為20∶1、提取時間為2 h。提取溫度選取50、60、70、80和90℃，考察其對提取得率的影響。

1.5.5 液料比對提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無水乙醇、原料粒度32目、回流溫度80℃、提取時間2h。液料比選取5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，考察其對提取得率的影響。

1.6 響應面法優化設計

本試驗采用Design expert8.0軟件中的Box-Behnken中心組合試驗設計響應面試驗。根據單因素試驗結果，選取提取時間、提取溫度和液料比3個因素作為試驗因素，以5-羥色胺衍生物提取得率為響應值設計試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of experimental response surface methodology

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溶劑對5-羥色胺衍生物提取得率的影響

圖1 不同提取溶劑對5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent type on 5-hydroxytryptamine derivatives

從圖1可以看出，不同提取溶劑對紅花籽粕中5-羥色胺衍生物提取得率影響較大。乙酸乙酯和甲醇的提取效果最好，無水乙醇的提取效果差一些。但無水乙醇安全、無毒，而且價格便宜、來源廣泛，適合工業化操作。因此，選取無水乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 原料粒度對5-羥色胺衍生物提取得率的影響

圖2 原料粒度對5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.2 Effects of size of material on 5-hydroxytryptamine derivatives

圖5 液料比對5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.5 Effects of liquid-to-solid ratio on 5-hydroxytryptamine derivatives

從圖2可以看出，原料粒度小于32目時，原料粒度對提取效果的影響非常大。原料的粒度大于32目時，原料粒度的升高對提取得率沒有影響?？紤]到原料進行長時間的粉碎會增加了操作成本，而且從圖1看，高于32目的粒度是沒必要的，確定32目為最佳原料粒度。

2.1.3 提取時間對5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖3可知，提取時間對提取率有較大影響，隨著提取時間的增加，5-羥色胺衍生物提取得率呈增長的趨勢，在2.0 h之后增長趨勢減緩，考慮到提取周期，選取1.5、2、2.5 h 進行中心組合試驗。

2.1.4 提取溫度對5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖4可知，5-羥色胺衍生物提取得率隨溫度升高而增加，在80℃之后，增長趨勢減緩，故選取提取70、80、90℃進行中心組合試驗。

2.1.5 液料比對5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖5可知，隨著液料比增加，5-羥色胺衍生物提取得率有所增加，在料液比15∶1之后，得率隨著用液量增加趨勢明顯減緩，考慮節約成本，選取液料比10∶1、15∶1、20∶1 進行中心組合試驗。

2.2 響應面法優化紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝

2.2.1 模型方差分析

對紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結果見表2。

表2 5-羥色胺衍生物提取工藝條件的優化試驗設計及結果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0軟件對各因素回歸擬合，得回歸方程:5-羥色胺衍生物提取得率=0.53+0.04X1+0.035X2+0.031X3-0.7344 × 10-3X1X2-4.403 ×10-3X1X3-0.013X2X3-9.187 ×10-3♂ -0. 015♂

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3可知，回歸模型(P＜0.0001)極顯著，相關系數 R2=0.9874，失擬項(P=0.5137 ＞0.05)影響不顯著，表明該模型擬合度很好，因此，可以用該回歸模型對實驗參數進行分析?；貧w模型方差分析的結果表明:X1、X2、X3、X2X3、X3X3(P ＜0.01)為極顯著項;X1X2、X1X1(P ＜0.05)為顯著項;其余項不顯著。通過F值得出:提取時間(X1)對5-羥色胺衍生物提取得率影響最顯著，其次是提取溫度(X2)，液料比(X3)的影響相對較少。

2.2.2 響應面分析

提取時間(X1)、提取溫度(X2)、液料比(X3)3個因素之間的交互作用對5-羥色胺衍生物提取得率的影響如圖6所示。其中，提取溫度與液料比(X2X3)之間的交互作用極顯著，隨著溫度和液料比的增加，5-羥色胺衍生物提取得率達到最大;提取時間與提取溫度(X1X2)之間的交互作用顯著;提取時間與液料比(X1X3)之間的交互作用不顯著。

依據所得模型，可預測穩定狀態下紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取最優工藝:提取溶劑為無水乙醇、原料粒度為32目、提取時間為2.4 h、提取溫度為89℃、液料比為19∶1。紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取得率可達0.34%。

2.3 工藝驗證

為了驗證該響應面分析法結果的可靠性，按上述最佳工藝(提取時間為2.4 h、提取溫度89℃、液料比19∶1)進行3次平行實驗，實際測得5-羥色胺衍生物提取得率的平均值為0.33%。表明預測值(0.34%)與實際值(0.33%)之間具有很好的擬合性，從而進一步證明優化結果的可靠性。

3 結論

本文在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計和響應面分析法對紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝進行了優化，得出最佳提取工藝:提取溶劑為無水乙醇、原料粒度為32目、提取時間為2.4 h、提取溫度為89℃、液料比為19∶1。回歸分析和驗證試驗結果表明，采用響應面法優化紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取工藝條件，得到的提取工藝流程具有實際應用價值。

圖4 因素間交互作用的響應曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots between factors

1 Guo ML(郭美麗)，Zhang HM(張漢明)，Zhang MY(張美玉).Herbological Study of"Honghua.J Chin Med Mater(中藥材)，1996，19:202-203.

2 Kumarasamy Y，et al.Biological activity of serotonin conjugates from the seeds of Centaurea nigra.Fitoterapia，2003，74:609-612.

3 Arze E，et al.Serotonin inhibition of tumor necrosis factor-alpha synthesis by human monocytes.Life Sci，1991，48:2557-2562.

4 Betten A，et al.Serotonin protects NK cells against oxidatively induced functional inhibition and apoptosi.Leukoc Biol，2001，70:65-72.

5 Jung SR，et al.Inhibitory effects of active compounds isolated from safflower(Carthamus tinctorius L.)seeds for melanogenesis.Biol Pharm Bull，2004，27:1976-1978.

6 Hotta Y，et al.Protective effects of antioxidative serotonin derivatives isolated from safflower against post ischemic myocardial dysfunction.Molecular and Cellular Biochemistry，2002，238:151-162.

7 Takii T，et al.Multiple mechanisms involved in the inhibition of proinflammatory cytokine production from human monocytes by N-(p-coumaroyl)serotonin and its derivatives.Intl.ImrMunophar macol，2003，(3):273-277.

8 Kang GH，Chang EJ，Choi SW.Antioxidative activity of phenolic conrpounds in roasted safflower(Carthamus tinctorius L)seeds.Food Sci Nutr，1999，4:221-225.