內質網蛋白29在食管癌中的表達及其臨床意義

唐衛文1，鄭駿年2，高 超3*

徐州醫學院1研究生院，3附屬醫院腫瘤科，江蘇徐州221006；2江蘇省沭陽協和醫院腫瘤科，宿遷223600

據最新統計顯示，世界癌癥死亡病例，食管癌在男性中占第5位，在女性中占第8位。世界癌癥新發病例，食管癌在男性中占第6位，在女性中占第10位以上[1]。我國是食管癌的高發區，2007年登記報告數據顯示，食管癌發病率為19.86/10萬，占第5位；食管癌死亡率為15.80/10萬，占第4位。我國食管癌高發區為河南林縣、太行山區、蘇北地區等[2-3]，食管癌已經成為嚴重威脅人民健康的重大公共衛生問題之一。食管癌的發生和發展是一個涉及多因素、多階段、多基因變異積累及相互作用的復雜過程，其具體機制尚不十分清楚。盡管食管癌的治療技術與手段如手術、化療及放療，取得長足的進步，食管癌患者5年生存率仍然較低，僅20～30%[4]。內質網分子蛋白與腫瘤的關系是近年來的研究熱點之一，內質網蛋白29（ERP29）的表達與多種腫瘤的關系研究方興未艾，而其與食管癌的關系國內外文獻尚未見相關報道。本研究擬通過免疫組化檢測ERP29在食管癌組織及癌旁食管正常組織中的表達，分析ERP29的表達與食管癌臨床病理特征以及預后等之間的關系，以明確ERP29在食管癌中的作用，以期指導臨床治療決策。

1 材料和方法

1.1 組織標本及臨床資料收集

收集自2007年1月至12月于解放軍第82醫院（作者單位合作醫院）腫瘤中心行手術治療的60例患者食管癌及癌旁正常組織標本，其中男44例、女16例，年齡42～68歲、平均56歲。并收集患者臨床資料包括腫瘤部位、癌組織學類型、分化程度、局部浸潤深度、區域淋巴結轉移情況、TNM分期及3年以上隨訪等。食管癌的病變部位分段標準及食管癌的TNM分期標準按國際分期第6版判定。組織學類型主要包括鱗狀細胞癌及腺癌。癌細胞分化程度分為高分化癌（G1）、中分化癌（G2）及低分化癌（G3、G4）。

1.2 主要化學試劑及主要儀器

主要化學試劑包括ERP29單克隆抗體購自Abcam 公司；HRP-Polymer抗羊 IgG（PV-6003）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 M，pH 7.2～7.4）、檸檬酸鹽緩沖液（0.01 M，pH 6.0）、TBS 緩沖液（100 mL，pH=7.6）、新鮮配制DAB溶液均自配。

主要儀器有AE200電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；OlympusAH-2型顯微鏡（日本Olympus公司）；微波爐（廣東格蘭仕電器有限公司）；石蠟切片機（上海倍曼生物科技有限公司）；KWY-450型電熱干燥箱（武漢實驗儀器廠）；AZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器有限公司）等。

1.3 免疫組織化學檢測ERP29及染色判定

免疫組織化學染色采用SP法。將石臘包埋的食管癌或癌旁組織塊切成3 μm厚，于60～65℃烤片4小時，備用。切片脫蠟，水化，依次為二甲笨Ⅰ→二甲苯Ⅱ→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各10分鐘。1×PBS緩沖液洗滌切片3次各5分鐘。石蠟切片組織抗原修復，采用高壓修復方法:先將切片專用耐高溫高壓切片架放好，然后放入還沒有加熱的檸檬酸鹽液中；將高壓鍋蓋好放至普通電爐上加熱，從開始加熱至壓力鍋噴氣約要15 min；從噴氣時開始計時，2 min后將壓力鍋端離電爐；自然冷卻壓力鍋，此過程約15 min；打開鍋蓋取出切片，1×PBS緩沖液洗滌切片5 min。3%H2O2（以PBS緩沖液）滴加在組織切片上，室溫（18～30℃）靜置 10分鐘。PBS洗 2～3次各1 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫10～15 min，甩去多余液體。滴加一抗ERp29抗體（稀釋倍數為1∶100），置于濕盒內，4℃過夜，防止切片干燥。陰性對照以PBS代替一抗。1×PBS洗3次各5 min。滴加二抗（HRP-Polymer anti-Goat IgG），室溫靜置20 min。1×PBS洗 3次各 1 min。DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度約3～5 min。自來水終止顯色。蘇木精復染，1%鹽酸酒精分化（分化時間為1 s）。自來水沖洗10～15 min。切片脫水、透明、封片，鏡檢。

免疫組織化學染色的判定以細胞漿中出現棕色顆粒為表達陽性，并用以下標準評價表達程度:著色強度評分:0分，未見染色（-）；1分，染成淺黃即輕度染色（+）；2 分，染成棕黃即中度染色（++）；3分，染成棕褐色即重度染色（+++）。陽性細胞百分比評分:0 分，＜5%；1 分，5%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。依據著色強度評分與陽性細胞百分比兩者評分乘積判定表達結果，0～2分判定為陰性，2分以上為陽性（2～4分為弱陽性，5～8分為中等陽性，9～12分為強陽性），陽性占總例數的百分比值為陽性表達率。

1.4 統計學處理

采用統計軟件SPSS13.0進行數據處理與分析。ERP29的表達與食管癌臨床、病理參數關系的分析采用Wilcoxon Mann Whitney檢驗。應用Kaplan-Meier法計算累積生存率，并用log-rank進行檢驗。

2 結 果

2.1 ERP29在食管癌組織和癌旁組織中的表達及關系

ERP29的表達，主要位于細胞質內，表現為細胞質內出現程度不等的棕色顆粒，部分細胞核也有表達。ERP29在食管癌旁組織中的陽性表達率為85%（見圖1A），而在食管癌組織中的陽性表達率為43.3%（見圖1B），兩者相比具有統計學差異（χ2=22.652，P＜0.001）。食管癌旁組織 ERP29的表達上升，而在癌組織的表達明顯下降，提示ERP29是一個潛在的抑癌基因。

圖1 ERP29的陽性表達（A）食管癌旁組織（B）食管癌組織

2.2 食管癌組織ERP29蛋白的表達與食管癌臨床病理特征的關系

卡方檢驗顯示，食管癌組織ERP29的陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、癌組織學類型及局部浸潤深度等無明顯相關性。但與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移呈負相關（見表1）。

表1 食管癌組織ERP29蛋白的表達與食管癌臨床病理參數的關系

2.3 食管癌組織ERP29蛋白的表達與食管癌預后的關系

食管癌組織ERP29表達陽性組食管癌患者術后1年生存率為92.3%，2年生存率為80.8%，3年生存率為65.4%，平均生存期為35.5個月。食管癌組織ERP29表達陰性組食管癌患者術后1年生存率為79.4%，2年生存率為55.9%，3年生存率為35.3%，平均生存期為28.7個月。根據Kaplan-Meier生存分析和檢驗，食管癌組織ERP29表達陽性與陰性患者的預后有統計學差異（P=0.037），見圖2。

圖3 不同ERp29表達的食管癌患者生存情

3 討 論

ERP29是一種分子量為29kDa的蛋白質，首先克隆于大鼠肝及牙釉質細胞[5-6]，廣泛表達于各種組織。ERP29在腫瘤發生、發展中的作用尚不清楚。一些研究發現，ERP29高表達于原發腫瘤及癌細胞株，并與腫瘤生長相關，然而另外一些研究也發現ERP29表達與腫瘤細胞增殖、腫瘤形成呈負相關。ERP29在C末端含有靶向內質網內腔的4肽內質網回收信號序列（KEEL）[5]。在人類，該蛋白質由第12號染色體上的單個基因表達，在哺乳類動物進化中具有高度的保守性[7]。ERP29蛋白具有2個結構域:N-端結構域與C-端結構域，其中N-端結構域與蛋白二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）的硫氧還原蛋白（thioredoxin）結構域類似，但是缺乏Cys-X-X-Cys結構，不能與硫氧還原蛋白結合，因此沒有PDI類似的氧化還原作用。C-端結構域為全螺旋結構，與PDI的p5亞族相似。兩結構域之間是自由轉動的寡氨基酸鏈。ERP29不同于傳統的分子伴侶，不能與ATP結合，亦不能與Ca2+結合[8-9]。ERP29是一個新的輔助蛋白折疊/分泌的內質網蛋白，可協助甲狀腺球蛋白及其它蛋白轉運至細胞外[10-12]。近年研究表明，ERP29表達與細胞放射、化療敏感性相關。Zhang等報道，放射處理小鼠腸上皮細胞或IEC-6細胞后，ERP29蛋白及mRNA表達水平均增高，并呈時間依賴性。反義轉基因抑制ERP29，IEC-6細胞對放射敏感性增加，細胞損傷加重[13]。Qi等亦報道，放射抗拒鼻咽癌組織與放射敏感鼻咽癌組織相比，前者Erp29表達增高。采用基因敲除Erp29，鼻咽癌細胞株CNE-1放射敏感性降低，但轉染ERP29致其過表達，鼻咽癌細胞株CNE-2放射抗拒增加[14]。ERP29的表達亦與腫瘤細胞化療敏感性相關。Zhang等報道，ERP29的表達可增加乳腺癌細胞株MDA-MB-231對阿霉素的抵抗性，并降低其誘導的細胞凋亡，但ERP29基因敲除后，細胞對阿霉素的毒性增加[15]。進一步研究表明，ERP29降低腫瘤細胞對阿霉素敏感性的機制與Hsp27及PERK相關[15-16]。本課題檢測了ERP29在食管癌中表達情況，發現少部分患者存在該蛋白的中等至強表達，提示這部分患者可能對放療及化療抗拒，因此對臨床治療決策具有一定指導意義。

ERP29在腫瘤發生、發展中的作用尚不清楚。一些研究發現，ERP29高表達于原發腫瘤及癌細胞株，并與腫瘤生長相關。Myung等采用二維電脈與基質輔助激光解吸附/電離質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF）分析10株不同的癌細胞與正常細胞分子伴侶的表達，發現SK-N-SH（人視神經母細胞瘤）、A549（人肺癌）、A-375（人黑色素瘤）、MCF-7（人乳腺癌）與Hela（人宮頸癌）等細胞株表達ERP29[17]。Cheretis等檢測104例皮膚基底細胞癌患者標本，37.5%表達ERP29，其中浸潤型癌表達更強，而表淺型表達較弱[18]。Mkrtchian等報道ERP29顯性負性突變（dominant-negative）或siRNA介導基因沉默化的人乳癌細胞MCF-7種植瘤，與過表達ERP29種植瘤相比，腫瘤小且分化較好。然而在體外培養ERP29的表達變化不影響細胞增殖。檢測人乳腺癌組織及靜止期和分泌期小鼠乳腺組織ERP29的表達，25%癌組織及分泌期小鼠乳腺組織表達，但靜止期小鼠乳腺組織不表達[19]。

然而另外一些研究也發現，ERP29表達與腫瘤細胞增殖、腫瘤形成呈負相關。Shnyder等報道人乳腺高轉移癌細胞MDA-MB-43，與低轉移癌細胞MCF-7相比，ERP29表達下降，并且ERP29表達與腫瘤進展呈負相關。由乳腺癌細胞MCF-7或結腸癌細胞COLO 205形成的生長較慢腫瘤，與由乳腺癌細胞MDAMB-435或結腸癌細胞W-620形成的生長較快腫瘤相比，前者ERP29表達增高[20]。Bambang等報道，與非癌組織相比，乳腺癌組織的ERP29表達下降，并與乳腺癌侵襲性特征相關。乳腺癌細胞MDA-MB-231過表達Erp29后，致細胞周期停滯于G0/G1期，并抑制細胞增殖，細胞發生表型改變，即間質-上皮轉化（mesenchymal-epithelial transition,MET），表現為細胞骨架重組，壓力纖維（stress fibers）缺失，纖維蛋白（fibronectin，FN）下降，上皮細胞標志物E-cadherin活化，間質細胞標志物vimentin喪失，細胞侵襲/轉移能力下降。采用shRNA敲除乳腺癌細胞MCF-7的ERP29后，E-cadherin表達下降，vimentin表達上升，并且細胞侵襲性能力增強。過表達ERP29的癌細胞MDA-MB-231種植祼鼠后，腫瘤形成受抑制[21]。因此，ERP29是一個潛在的抑癌基因[22]。本課題檢測ERP29在食管癌及癌旁組織中的表達，亦發現食管癌組織ERP29的表達下降，并且ERP29的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移呈負相關，但與患者年齡、性別、腫瘤部位、癌組織學類型及局部浸潤深度等無明顯相關性。然而，ERP29抑制腫瘤發展的機制尚不清楚，可能與抑制ERK信號通路等相關[21]。

本組患者食管癌組織ERP29表達陽性組1、2及3年生存率分別為92.3%、80.8%、65.4%，高于食管癌組織ERP29表達陰性組79.4%、55.9%、35.3%。根據Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗，食管癌組織ERP29表達陽性與陰性患者相比，有統計學差異。食管癌旁組織ERP29呈高表達，而在食管癌組織ERP29的表達明顯下降。并且，食管癌組織ERP29的表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、癌組織學類型及局部浸潤深度等無明顯相關性，但與腫瘤分期、淋巴結轉移呈負相關。兩者均提示ERP29是一個潛在的抑癌基因。而食管癌組織ERP29的表達與患者預后相關，提示ERP29可作為預測食管癌預后的一個潛在指標。

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