金屬硫蛋白1H在晚期非小細胞肺癌中的表達及預后分析

許林平，張瑞芳，馬 臣，樊青霞，買 玲

(1.河南省腫瘤醫院 河南鄭州 450008;2.新鄉醫學院公共衛生學院 河南新鄉 453003;3.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤內科 河南鄭州 450052)

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一。據世界衛生組織2008年的統計數據顯示，現在每年肺癌新發病例約160萬例，占所有癌癥新發病例的12.7%［1］。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80% ～85%，確診時約2/3的患者為不可切除的晚期患者［2］。鉑類抗癌藥一直是治療非小細胞肺癌的主要藥物，特別是順鉑類抗癌藥。目前仍以含鉑方案化療作為治療晚期非小細胞肺癌的主要手段。20世紀90年代以來，隨著第3代抗癌藥物的出現［健澤(gemcitabine)、諾維本(vinorelbine)、泰素(taxol)、泰索帝 (taxotere)、伊立替康 (CPT-11)］，晚期肺癌病人的治療效果有了一定的提高，非鉑類治療方案也成為一種較好的選擇。如何在現有基礎上進一步提高鉑類藥物使用的針對性，成為臨床研究熱點。金屬硫蛋白(MT)是生物體內普遍存在的一類金屬結合蛋白，人MT基因是包括10個功能性基因和7個非功能性基因的異構體，MT1H是其中一個功能性基因。研究證實，細胞內含巰基蛋白以MT為主，而腫瘤細胞耐藥與細胞解毒體系含巰基蛋白的過量表達有關。故MT在腫瘤耐藥中的作用，尤其是順鉑(DDP)耐藥已引起臨床關注。已發現MT與腫瘤發生、發展密切相關，但其各種異構體的功能尚不完全清楚［3］。我們回顧性分析了2006年5～9月所有入院非小細胞肺癌病人的MT1H表達與晚期非小細胞肺癌(NSCLC)臨床病理特征及其與病人生存的關系，試圖篩選出預測腫瘤耐藥的指標，以提高臨床化療的針對性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學第一附屬醫院、河南省腫瘤醫院2006年5～9月完成含鉑方案(Gemcitabine+DDP或NVB+DDP方案)化療2個完整周期的40例可靠NSCLC的病歷資料(均為喪失手術時機或不愿手術、放療的初治患者，均經病理診斷確診)。其中男性25例，女性15例，平均年齡58歲。參照WHO分類標準，其中鱗癌(SC)17例，腺癌(AC)23例;高、中分化癌19例，低分化癌21例;按國際肺癌TNM分期標準，Ⅲa期7例，Ⅲb期16例，IV期17例。有淋巴結轉移者19例，無轉移者21例。

1.2 治療方法 40例患者均有2個周期完整的含順鉑方案(Gemcitabine+DDP或異長春花堿+DDP方案)治療，化療前及化療第2周期的第5～6周分別抽取外周血，并拍攝胸片或胸部CT。根據WHO療效標準，完全緩解或部分緩解者為化療有效，穩定者或進展者為化療無效。40例患者中有39例有完整的隨訪資料，生存期自化療首日至死亡或失訪日止。隨訪48～1 095 d，中位隨訪 264 d，平均隨訪 414.61 d。

1.3 MT-1H 基因檢測

1.3.1 總RNA的提取:采取患者外周靜脈血2 ml加入2%乙二胺四乙酸鹽(1∶9)抗凝，迅速送檢。采用分離試劑提取RNA。紫外分光光度計測定RNA含量和純度。

1.3.2 RT-PCR檢測:用AMV逆轉錄酶制備cDNA，取cDNA進行PCR擴增。MT1H引物為:P1，5’-CCA GTC TCA CCT CGG CTT G-3’;P2，5’-TAG CAA ATG AGT CGG AGT TGT-3’，擴增片段大小為294 bp。βaction(作為內參照)引物為:P1，5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT-3’;P2，5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，擴增片段為480 bp。擴增條件為:94℃2 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環;72℃ 5 min。

1.3.3 結果判斷:取 5 μl擴增產物，用含 EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在VDS800凝膠成像系統中半定量分析，每份標本均觀察到480 bp位置的β-action特異性擴增條帶，證實逆轉錄所得的cDNA的完整性以及PCR反應成功。MT1H陽性結果為兩條帶:MT1H為294 bp，β-action為480 bp。以兩條帶之積分光密度比值反映MT1H基因的相對表達水平。其標準為 MT1H/β-action ≥0.2 為陽性表達，MT1H/β-action＜0.2時為陰性表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0進行分析。半定量結果用±s表示，經方差齊性檢驗后行t檢驗和單因素方差分析(檢驗水準α=0.05)。生存分析用Ka-plan-meier法和Cox回歸分析。

2 結果

2.1 化療前后MT1H表達 40例患者化療后MT1H表達(0.53 ±0.23)明顯高于化療前(0.43 ±0.26)，化療前后比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 化療前MT1H表達與臨床病理特征的關系 化療前MT1H表達與患者性別、年齡、腫瘤組織學類型和TNM分期無關(P＞0.05);AC與腫瘤的分化程度及是否淋巴結轉移有關，即MT1H在高、中分化肺癌的陽性表達比低分化肺癌陽性表達低，無淋巴結轉移陽性表達比有淋巴結轉移陽性表達低(P均＜0.05)。見表1。

2.3 化療效果與化療前后MT1H表達 40例中有效21例，無效19例。化療前后MT1H表達在有效組中差異無統計學意義(P＞0.05)，無效組中差異有統計學意義(P＜0.05)。化療前后MT1H表達差值在有效組中是(0.04 ±0.31)，無效組中是(0.18 ±0.20)，兩組相比差異無統計學意義(t=-1.69，P＞0.05)。見表2。

表1 化療前MT1H表達與NSCLC患者臨床病理特征關系

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達差異比較 (±s)

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達差異比較 (±s)

注:*表示有效組和無效組化療前后表達差值比較。

組別 n 化療前 化療后 t P MT-1H表達差異MT-1H t P有效 21 0.45 ±0.32 0.49 ±0.16 －0.560 0.582 0.04 ±0.31 －1.69 0.10*無效 19 0.41 ±0.19 0.58 ±0.29 －3.905 0.001 0.18 ±0.20

2.4 PCR擴增產物電泳圖 見圖1、圖2。

2.5 MT表達與患者生存的關系

2.5.1 預后因素的單因素分析:MT陰性組中位生存期是304 d，陽性組是246 d，提示MT高表達可能會導致晚期非小細胞肺癌的預后較差，但用Kaplan-meier法進行單因素的生存分析得 χ2=1.6，P=0.206，差異無統計學意義。見圖3。

2.5.2 Cox 回歸模型多因素分析［4，5］:應用 Cox 模型強制進入法分析患者的性別、年齡段、病理分型、分期、分化程度、淋巴結轉移情況、MT等多個因素對晚期NSCLC生存的影響。結果顯示年齡段是影響晚期NSCLC預后的獨立因素，MT可能是影響晚期NSCLC預后的獨立因素。見表3。

圖3 MT陽性組與陰性組生存曲線

表3 40例NSCLC患者的COX預后多因素回歸分析

3 討論

由于NSCLC早期診斷率低，約80%的患者就診時己失去手術機會。第3代抗癌藥的聯合化療有效率僅為30% ～40%，5年生存率不足15%［6］。化療失敗的主要原因是腫瘤對化療藥物的原發性耐藥及獲得性耐藥。研究顯示，MT與腫瘤耐藥有關，但在人發育不同時期或在不同生理條件下不同MT異構體功能不同。本文結果證實，本研究中40例NSCLC患者，化療后MT1H表達相對化療前有增高趨勢，提示可能存在化療后的獲得性耐藥。Oguri等［7］認為，此與體內化療藥物誘導和對異生化合物生理壓力反應有關。本研究結果顯示，MT1H在NSCLC中的表達與患者的性別、年齡、TNM分期無關，并且在AC中的表達強度無統計學差異，說明組織學類型與MT1H的表達無明顯相關性。淋巴結轉移及腫瘤分化程度與MT1H的表達有相關性，隨著分化程度的降低MT1H的表達逐漸增強，提示NSCLC的發生、發展及轉移過程中可能有MT1H的參與。這與乳腺癌和食管癌等腫瘤中MT的表達報道一致［8］。MT1H在惡性較高的NSCLC中更趨于表達，表明MT1H很可能是一種反映腫瘤惡性程度的生物學指標，有可能作為臨床確定治療方案及判斷預后實驗室指標的參考依據。目前關于MT1H與臨床療效的關系尚無定論。Wood等［9］研究認為，MT表達與膀胱癌含順鉑方案化療敏感性無關;Kotoh等［10］認為，在泌尿系移形細胞癌中MT表達水平與含順鉑方案化療敏感性呈負相關。本研究顯示，MT1H表達與化療效果無明顯相關性，尚不能預測化療療效。多數報道認為MT表達與生存情況為負相關的關系，如用含順鉑方案化療的泌尿系腫瘤，MT蛋白與生存有關［11］。丁華野等［12］研究認為，MT 表達與乳腺癌生存呈負相關，Joseph等［13］認為MT表達與小細胞肺癌生存呈負相關。本研究顯示MT表達情況可能與采用含鉑方案化療病人的生存情況呈負相關，但經統計學檢驗差異無統計學意義，這可能與化療對晚期非小細胞肺癌生存改善有限有關。此外，患者入院時肺癌的分期情況、后續采取治療方案的情況及治療時病人的心態都會對生存情況產生影響。同時未做亞組分析，可能也會對結果產生一定的影響。另外，本研究可能存在一些其他的因素未被排除，從而對結果產生影響。若想進一步研究，提高預測的準確性及化療選藥的針對性，需增加樣本例數，采用隨機分組，并采用多個可能對研究有影響的耐藥指標進行聯合檢測。

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