幾株益生乳酸菌對Caco－2細胞的黏附及其對致病菌黏附的影響

白 潔 李衛芬 黃 琴 崔志文 余東游 黃 怡，2*

(1.浙江大學動物科學學院，浙江大學動物分子營養學教育部重點實驗室，杭州 310058;2.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005)

黏附是微生物與宿主腸道相互作用的第1步，也是進入腸道的微生物發揮作用的前提［1］。黏附和定植于宿主腸道的能力是益生菌的評價標準之一，益生菌株必須對上皮細胞組織具有黏附性才能長期在腸道中存活并發揮其作用［2］。黏附在腸道的益生菌可以通過空間占位，產生抑菌物質等對腸道病原菌發揮抑制作用，調整腸道菌群平衡。同時，黏附也是感染性細菌致病的第1步，如果能抑制病原菌對宿主細胞的黏附，往往能抑制病原菌的致病作用［3］。因此，人們常將益生菌的黏附性能及其對致病菌的黏附抑制作用作為菌株質量評定的重要指標。目前，國內外有關乳酸菌對細胞的黏附及其對病原菌的黏附抑制作用的研究報道較多，并且發現一些有較好黏附性能的益生乳酸菌［4－5］，但是關于其對腸上皮細胞的黏附是否具有菌屬和宿主特異性方面的研究報道較少。腸上皮樣細胞系Caco－2細胞是從人結腸腺癌中建立的，是目前研究細菌或病毒與腸道黏膜黏附應用最廣泛的細胞模型。該細胞模型能夠在體外進行形態功能分化，表現出成熟腸上皮細胞的特性。因此，本試驗采用目前國內外學者普遍使用的體外培養Caco－2細胞的方法來評價幾株不同來源的益生乳酸菌的黏附能力及其對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用，并探討不同種屬及來源的菌株對Caco－2細胞的黏附性能的差異，為乳酸菌更好地應用于生產及探討其黏附機制提供初步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和細胞株

L1～L6 6個乳酸菌菌株，L1:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，編號為 6001)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心;L2:食果糖乳桿菌(Lactobacillus fructivorans，編號為6052)凍干粉，購于中國食品發酵工業研究院;L3:乳桿菌(Lactobacillus)，分離于健康雞腸道;L4:糞腸球菌(Enterococcus faecalis，編號為20426)凍干粉，購于中國食品發酵工業研究院;L5:屎腸球菌(Enterococcus faecium)，由浙江大學飼料科學研究所微生物與基因工程實驗室保存;L6:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，編號為23609)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。2個致病菌菌株，K88:大腸桿菌(Escherichia coli)K88，購自國家獸醫微生物菌種保藏管理中心;S:鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，購自國家獸醫微生物菌種保藏管理中心。Caco－2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑和設備

MRS、GM17和 LB培養基(英國 Oxoid公司);DMEM培養液、0.25%胰酶［含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)］、D－hank’s平衡鹽溶液(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);青霉素和鏈霉素(美國Sigma公司);Triton X－100和臺盼藍染色液(美國Ameresco公司)。細胞培養瓶及培養板(美國Gibco公司);5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);HERA cell 150 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司);CX41－12C02倒置顯微鏡(日本Olympus公司);NOVEL XSZ－N107CCD光學顯微鏡(寧波永新光學股份有限公司);UV－2100紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);Synergy 4酶標儀(美國BioTek公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌液制備

除了乳酸乳球菌用GM17培養基外，其他乳酸菌都用MRS培養基培養。乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌－80℃保存，試驗前乳酸菌接種于新鮮配制的GM17或MRS液體培養基，30℃靜止培養24～36 h，并轉接2代。大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌接種于LB培養基，37℃搖床培養過夜，并轉接2代。分別將生長至對數生長期的乳酸菌(16 h)、大腸桿菌K88(8 h)和鼠傷寒沙門氏菌(10 h)在4 000 r/min、15℃離心10 min，收集菌體，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后重懸于無菌PBS中，調節細菌的濃度為2×108CFU/mL。

1.3.2 細菌熒光標記

按照文獻［6］和［7］的方法標記細菌。把上述準備好的乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌(1×109CFU/mL)懸浮于100 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)中，37℃暗處作用1 h，用PBS洗滌4次去除未結合的FITC，然后把細菌懸浮于PBS中，并調整細菌的終濃度為1×108CFU/mL，每組設6個重復，每個培養孔為1個重復。

1.3.3 Caco－2 細胞的培養

Caco－2細胞用培養瓶培養，在瓶中加入含10%熱滅活的胎牛血清和雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的DMEM 細胞培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每2 d換1次培養液。待細胞貼壁生長為單層細胞后(5～7 d)，用0.25%胰酶消化傳代，并用0.4%的臺盼藍染色液染色，用血細胞計數器在顯微鏡下檢測細胞的數量和活性，保證細胞活性在95%以上。

1.3.4 黏附試驗

以不加菌的細胞為空白對照，試驗組加入1 mL培養液及1 mL熒光標記的乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌(1×108CFU/mL)，將培養板置于37℃，5%CO2的培養箱中分別孵育1 h后，用無菌PBS洗滌3次，將未黏附的菌洗脫。之后每個培養孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養液終止反應。收集液體，用酶標儀測定其熒光強度，吸收光波長為485 nm，發射光波長為530 nm，測定相對熒光強度，每個組設6個重復，每個培養孔為1個重復。

計算公式:

式中:A為乳酸菌、大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細胞并洗脫后細胞懸液的相對熒光強度;A0為乳酸菌、大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細胞前細胞懸液的相對熒光強度。

1.3.5 黏附抑制試驗

在96孔板中，每孔加入以上調整好濃度的細胞懸液100 μL。試驗設3個處理，通過熒光標記法，采用競爭、排斥和置換試驗來研究乳酸菌對病原菌的黏附抑制作用。

1.3.5.1 競爭試驗

Caco－2細胞 +乳酸菌(未標記)+致病菌(FITC標記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→PBS洗滌3次→PBS重懸→轉移至黑色的96孔板，避光靜置。

1.3.5.2 排斥試驗

Caco－2細胞 +乳酸菌(未標記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→加入致病菌(FITC標記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→其余操作同1.3.5.1。

1.3.5.3 置換試驗

Caco－2細胞 +致病菌(FITC標記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→加入乳酸菌(未標記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→其余操作同1.3.5.1。

以上處理結束后，各處理的每個培養孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養液終止反應。收集液體，用酶標儀測定其熒光強度，每組設6個重復，每個培養孔為1個重復。

計算公式:

式中:A1為無乳酸菌存在的情況下，黏附在Caco－2細胞上的大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌的相對熒光強度;A2為乳酸菌存在的情況下，黏附在Caco－2細胞上的大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌的相對熒光強度。

1.4 數據分析

試驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件作統計學分析，用t檢驗法進行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對Caco-2細胞的黏附作用

由圖1可見，參試的8株菌株的黏附率乳桿菌(L2、L3、L1) ＞ 腸球菌(L5、L4) ＞ 致病菌(K88、S)＞乳球菌(L6)，其中乳酸菌 L1、L2、L3和 L5的黏附率超過50%?？梢?，研究的這幾株益生乳酸菌的黏附性能較好，同時說明乳酸菌對腸上皮細胞的黏附有菌屬特異性。分離于健康雞腸道的乳桿菌L3和來源于人腸道的乳桿菌L1、L2一樣有較高的黏附率，這說明乳酸菌對腸上皮細胞的黏附可能無宿主特異性。

圖1 益生乳酸菌對Caco-2細胞的黏附率Fig.1 The adhesion rate of lactic acid bacteria strains to Caco－2 cells

2.2 益生乳酸菌對大腸桿菌K88黏附Caco-2細胞的影響

由表1可知，乳酸菌L1、L2、L3和 L4對大腸桿菌K88黏附Caco－2細胞的影響相似，都能通過置換作用阻止大腸桿菌K88的黏附，相對置換率分別為:42.51%、21.07%、52.49%和37.85%，其中乳酸菌L1、L3和L4的大腸桿菌K88黏附率均極顯著降低(P＜0.01)。相反，競爭試驗或者排斥試驗總體上能促進大腸桿菌K88對腸上皮細胞的黏附作用。乳酸菌L5在競爭、排斥和置換試驗中都能促進大腸桿菌K88的黏附，乳酸菌L6則能夠通過競爭和置換作用降低大腸桿菌K88的黏附，相對降低率分別為6.43%和47.86%?？梢姡樗峋鷮Υ竽c桿菌K88的黏附影響沒有菌屬特異性，而且與乳酸菌自身的黏附力也沒有必然聯系。

2.3 益生乳酸菌對鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco-2細胞的影響

由表2可知，所有的乳酸菌都能夠通過置換作用減少鼠傷寒沙門氏菌的黏附，乳酸菌L1～L6相對置換率分別為27.38%、11.59%、50.53%、23.16%、57.91%和36.84%，其中 L1、L3～L6的鼠傷寒沙門氏菌黏附率極顯著降低(P＜0.01)。除了L3外，其他5株益生乳酸菌都通過競爭作用顯著(P＜0.05)或極顯著地(P＜0.01)促進其黏附，且所有的乳酸菌都通過排斥作用極顯著促進其對Caco－2細胞的黏附(P＜0.01)。這表明置換作用是這6株乳酸菌阻止鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細胞的主要方式。它們對鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用沒有菌屬特異性，與乳酸菌自身的黏附力也沒有關聯。

表1 乳酸菌對大腸桿菌K88黏附Caco-2細胞的影響Table 1 Effects of lactic acid bacteria strains on adhesion ability of Escherichia coli K88 to Caco－2 cells %

表2 乳酸菌對鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco-2細胞的影響Table 2 Effects of lactic acid bacteria strains on adhesion ability of S.typhimurium to Caco－2 cells %

3 討論

隨著抗生素在全球動物生產中的禁用，益生菌成為研究的熱點，乳酸菌作為益生菌的一種，因其能夠改善胃腸道功能、提高動物免疫力和生產性能等，在動物生產中得到了極大的推廣和應用。對于益生菌的作用機理，目前普遍認為黏附是其發揮益生作用的前提，也是細菌與宿主相互作用的第1步。菌群在腸道內的定植是通過細菌的黏附作用來實現的，乳酸菌進入腸道能否黏附于宿主某段腸道的黏膜細胞表面，形成穩定的優勢菌群，是決定這種益生素實際效果的重要因素。Gopal等［8］報道3株飼用乳酸菌菌株對人腸道上皮細胞系 HT－29、Caco－2 和 HT29－MTX 細胞有極強的黏附力，而且3株乳酸菌都能降低大腸桿菌O157∶H7對腸細胞的侵襲能力和細胞結合能力。陳臣等［9］研究發現3株乳桿菌對Caco－2細胞均有較好的黏附能力，尤其是植物乳桿菌ST－Ⅲ，其黏附率高于被深入研究的鼠李糖乳桿菌。本試驗發現，試驗菌株黏附率從高到低依次為乳桿菌＞腸球菌＞致病菌＞乳球菌，說明乳酸菌在體外對腸上皮細胞有較好的黏附性能，與上述報道基本一致。同時說明乳酸菌對Caco－2細胞的黏附有菌屬特異性，這與Nissen等［10］報道的結果一致。這可能與黏附素有很大的關系，黏附素是一種與黏附相關的分泌型蛋白質，它可介導菌體與細胞膜受體的連接，此類分泌型蛋白質分子的水平在很大程度上可能不盡一致，由此表現出乳酸菌黏附性能的差異。本試驗發現分離于健康雞腸道的乳桿菌L3和來源于人腸道的乳桿菌L1、L2對Caco－2細胞的黏附率沒有顯著差異。王斌等［11］認為，乳桿菌對腸上皮細胞的黏附有宿主特異性，而與此相反，李平蘭等［12］卻發現，分離自人糞便與豬糞便的同屬乳酸菌黏附HT－29細胞的能力沒有顯著差異。本試驗結果提示乳酸菌的黏附可能無宿主特異性，與李平蘭等［12］的研究結果一致，但要確定乳酸菌是否具有宿主特異性還需進一步的試驗驗證。本試驗發現幾乎所有乳酸菌均能通過置換作用抑制大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌對腸上皮細胞的黏附，但是通過競爭作用和排斥作用不但不能抑制反而促進病原菌的黏附。雖然不同種屬和菌株的益生乳酸菌對腸道致病菌的黏附抑制作用不同［13］，但是很多益生乳酸菌抑制腸致病菌黏附腸上皮細胞都是通過排斥、競爭或置換作用實現。Matija?ic'等［14］研究發現，格氏乳桿菌通過排斥和競爭作用抑制大腸桿菌K88黏附Caco－2細胞。郭彤等［15］報道，嗜酸乳桿菌能夠通過排斥、競爭或置換作用明顯抑制大腸桿菌K88和豬霍亂沙門氏菌黏附 Caco－2 細胞。Tuomola 等［16］和 Collado等［17］分別報道過乳酸桿菌和雙歧桿菌對病原菌黏附的促進作用，但具體原因尚不清楚。但是體外細胞試驗是在人為的簡單的環境中進行，與體內真實復雜的環境還是有區別的。在宿主的腸道內，腸上皮細胞表面還覆蓋有一層由一些糖蛋白類物質組成的黏液層，黏蛋白是其中主要的一種糖蛋白，其上分布有腸菌群的一些特異性結合位點。益生菌的黏附特點可能與其細胞壁成分或代謝產物有關。益生細菌細胞壁的成分(如脂膜酸)及其含量或者代謝物質及其分泌量，以及細菌表面的特性都影響其黏附力［18－19］，從而導致其對病原菌黏附性能的影響不同。Mangell等［20］認為有黏附力的益生菌不容易因腸蠕動而隨食糜排出體外，從而容易在腸道中定植，構成抵抗致病菌入侵的微生物屏障，發揮更持久的保護作用。因此，黏附力一直是受人關注的腸道益生菌特性之一。本試驗中的乳酸菌菌株黏附性能較好，但是關于其對病原菌的黏附抑制作用及其乳酸菌的黏附是否具有宿主特異性還有待進一步研究以得到更加明確的結果。對于乳酸菌的黏附機理也還需要進一步的研究，以期能在動物生產上更好地利用黏附特性來挑選乳酸菌進行生產試驗，從而對其提高動物機體免疫力的能力有更好的評價。

4 結論

①乳酸菌對腸上皮細胞有較高的黏附率，尤其是乳桿菌。

②乳酸菌對腸上皮細胞的黏附有菌屬特異性。

③乳酸菌對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用主要通過置換方式，但沒有菌屬特異性，且與自身的黏附力也沒有必然的聯系。

［1］COTTER P A，MILLER J F.Triggering bacterial virulence［J］.Science，1996，273:1183 － 1185.

［2］COLLINS J K，THORNTON G，SULLIVAN G O.Selection of probiotic strains for human applications［J］.International Dairy Journal，1998，8:487 － 490.

［3］范小兵，周叢，杭曉敏，等.昂立植物乳桿菌黏附腸上皮細胞的研究［J］.中國微生態學雜志，2004，16(6):353－355.

［4］王斌，李秋榮，劉放南，等.1株腸道高黏附性乳桿菌的分離鑒定［J］.中國生物制品學雜志，2008，21(6):473－477.

［5］CANDELA M，PERNA F，CARNEVALI P，et al.Interaction of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains with human intestinal epithelial cells:adhesion properties，competition against enteropathogens and modulation of IL－8 production［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，125(3):286 －292.

［6］VINDEROLA C G，MEDICI M，PERDIGóN G.Relationship between interaction sites in the gut，hydrophobicity，mucosal immunomodulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(2):230－243.

［7］BONAR A，CHMIELA M，RUDNICKA W，et al.Mannose－binding lectin enhances the attachment and phagocytosis of mycobacteria in vitro［J］.Archivum Immunologiae et Therapia Experimentalis，2005，53:437－441.

［8］GOPAL P K，PRASAD J，SMART J，et al.In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic Escherichia coli［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，67(3):207 －216.

［9］陳臣，郭本恒，陳衛，等.三株益生菌黏附性質及機制的初步研究［J］.中國微生態學雜志，2007，19(6):492－494.

［10］NISSEN L，CHINGWARU W，SGORBATI B，et al.Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp.strains:a functional study in the small intestinal cell model［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，135(3):288－294.

［11］王斌.乳桿菌黏附機制的研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2006，27(3):224 －226.

［12］李平蘭，楊華，張篪.乳酸菌體外黏附人結腸腺癌細胞系HT－29細胞的研究［J］.中國農業大學學報，2002，7(1):19 －22.

［13］GUEIMONDE M，JALONEN L，HE F，et al.Adhesion and competitive inhibition and displacement of human enteropathogens by selected Lactobacilli［J］.Food Research International，2006，39(4):467 － 471.

［14］MATIJA?IC'B B，NARAT M，PETERNEL M Z，et al.Ability of Lactobacillus gasseri K7 to inhibit Escherichia coli adhesion in vitro on Caco－2 cells and ex vivo on pigs’jejunal tissue［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，107(1):92 －96.

［15］郭彤，胥保華，馬玉龍，等.嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌體外黏附Caco－2細胞及其對病原菌黏附性能的影響［J］.中國獸醫學報，2008，28(5):527 －531.

［16］TUOMOLA E M，OUWEHAND A C，SALMINEN S J.The effect of probiotic bacteria on the adhesion of pathogens to human intestinal mucus［J］.FEMS Immunology ＆ Medical Microbiology，1999，26(2):137－142.

［17］COLLADO M C，GUEIMONDE M，HERNáNDEZ M，et al.Adhesion of selected Bifidobacterium strains to human intestinal mucus and the role of adhesion in enteropathogen exclusion［J］.Journal of Food Protection，2005，68(12):2672 －2678.

［18］陳臣，郭本恒，王蔭榆，等.植物乳桿菌ST－Ⅲ黏附腸上皮樣細胞系Caco－2性質的研究［J］.乳業科學與技術，2008，31(2):51 －55.

［19］GRANATO D，BERGONZELLI G E，PRIDMORE R D，et al.Cell surface－associated elongation factor Tu mediates the attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533(La1)to human intestinal cells and mucins［J］.Infection and Immunity，2004，72(4):2160 －2169.

［20］MANGELL P，LENNERNAS P，WANG M，et al.Adhesive capability of Lactobacillus plantarum 299v is important for preventing bacterial translocation in endotoxemic rats［J］.Acta Pathologica，Microbiologica et Immunologica Scandinavica，2006，114(9):611 －618.