水通道蛋白3在非小細胞肺癌中的表達及與臨床病理相關性的研究

李白翎 金磊 鐘鏗 杜大海

水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是一組分子量約30 kDa的（單體）疏水性膜轉運蛋白，屬于主要固有蛋白（major intrinsic protein, MIP）家族[1]。近年來，AQPs的表型及臨床病理相關研究取得了重大進展[2]。其中AQPs的染色體定位、基因結構、表達調控、蛋白構象、組織分布和生理功能方面研究較為深入，但AQPs功能對腫瘤的影響至今尚未明確。最近研究[3]發現AQP3在腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和血管生成中發揮了重要的作用。已有研究[4]證實AQP3在多種不同來源的腫瘤中表達水平較高，尤其是在侵襲性強的腫瘤中。但AQP3在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）組織中的表達及與臨床病理參數間的關系，國內外鮮有報道。本研究應用免疫組化法檢測NSCLC中AQP3的表達情況，并分析其與微血管密度（micro vascular density, MVD）及臨床病理參數間的相關性，為進一步研究AQP3在NSCLC發生、發展中的作用機制提供依據。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2006年1月-2006年12月上海長海醫院胸心外科手術切除的NSCLC標本180例，術前未行任何抗腫瘤治療；其中男性117例，女性63例。患者年齡43歲-79歲，平均年齡54.7歲。病理分型為鱗癌64例，腺癌99例，大細胞癌10例，其它病理類型7例。所有標本均經過病理組織學診斷證實，癌旁組織作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 AQP3免疫組化試劑盒購自美國 Santa Cruz公司；即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德公司，CD34單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2.2 免疫組織化學分析 免疫組化染色采用SABC（streptavidin-biotin complex）法，高溫抗原修復，染色程序參照說明書進行。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定 采用雙盲法，由兩位病理科醫師分別讀片。AQP3陽性判斷：在胞膜、胞漿呈現棕黃色或棕褐色。每張切片隨機選擇5個不同視野計數，結果取其平均值。AQP3免疫組化評分方法：選擇5個高倍視野（×200）計數細胞總數和陽性細胞數，得出陽性細胞百分率，其中：陽性細胞數＜ 5%為陰性，計0分；5%-25%為弱陽性，計1分；26%-50%為中等強度陽性，計2分；＞50%為強陽性，計3分。按染色強度：弱為0分，中為1分，強為2分，共3級?？傇u分值=陽性細胞比例評分+染色強度評分；總評分值≤2分為陰性，3分-4分為中等強度陽性（+），5分-6分為強陽性（++）。

1.4 MVD計數 采用CD34染色計數MVD值。CD34定位于血管內皮細胞膜和胞漿，陽性者呈棕色。腫瘤MVD計數按照Weidner[5]方法進行。

1.5 統計學分析 所有數據均采用SPSS 11.0統計軟件進行分析。采用方差分析（方差齊LSD-t檢驗，方差不齊Tamhane檢驗）比較不同組織中AQP3蛋白陽性染色結果總評分，率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織、癌旁組織中AQP3的表達 AQP蛋白陽性表達主要定位于胞膜、胞漿，呈現棕黃色或棕褐色。正常肺組織中，AQP3分布于肺泡II型上皮細胞、氣道粘液上皮細胞胞質和頂膜及部分粘液腺細胞基底。免疫組化結果顯示：NSCLC組織中AQP3陰性表達率為13.9%（25/180），中等強度陽性表達率為37.2%（67/180），強陽性表達率為48.9%（88/180）。NSCLC組織中AQP3表達高于癌旁組織（圖1），有明顯統計學差異（P＜0.01）。

2.2 MVD與AQP3表達的相關性研究 CD34染色定位于血管內皮細胞，呈棕黃色。腫瘤間質中見大量血管內皮細胞陽性染色，微血管分布不均（圖2）。NSCLC組織中MVD計數為51.2±21.6，明顯高于癌旁組織15.2±3.1（P＜0.01）。根據AQP3在NSCLC中的不同表達水平，分析其對MVD計數的影響，研究其相關性（表1）。結果顯示AQP3的表達與MVD表達密切相關，AQP3高表達的同時伴隨著MVD計數增高（P＜0.01）。

2.3 NSCLC組織中AQP3的表達與臨床病理參數的關系表2顯示了AQP3表達和NSCLC臨床病理參數之間的關系。男性患者AQP3中等強度表達37例（31.6%），強陽性表達65例（55.6%），明顯高于女性患者（P=0.003）。與鱗癌相比，腺癌中AQP3表達水平明顯較高，其中中等強度表達29例（29.2%），強陽性表達65例（65.7%）（P＜0.001）；并且，發生淋巴結轉移的病例往往伴隨著AQP3的高表達（P=0.026）。NSCLC中AQP3的表達與腫瘤分化程度呈明顯正相關，表現為AQP3的陽性表達率在高分化癌中明顯高于低分化癌（P＜0.001）。但AQP3的表達情況與年齡、TNM分級等無相關性（P＞0.05）。

表 1 MVD與AQP3表達的相關性分析Tab 1 MVD according to the combination of AQP3 expressions

圖 1 AQP3在NSCLC及癌旁組織中的表達（SABC, ×200）Fig 1 Expression of AQP3 in NSCLC and adjacent tissues (SABC, ×200). NSCLC: nonsmall cell lung cancer.

圖 2 肺癌及癌旁組織中的MVD計數（SABC, ×200）Fig 2 The MVD counts in NSCLC and adjacent tissues (SABC, ×200)

表 2 NSCLC中AQP3的表達及與臨床病理特征的關系Tab 2 AQP3 expression and clinicopathological factors in NSCLC

3 討論

AQP是一種內在膜蛋白， AQP3是AQP家族成員之一，是第1個被發現的除了對水有通透性以外，還能夠通透甘油和尿素的AQP。最新研究[6]發現AQP3參與了腫瘤的血管生成過程。人們已經發現起源于腦、胃、腎、結直腸等至少12種不同來源的人類腫瘤細胞有AQP3表達[1]，本研究結果顯示人類NSCLC細胞亦存在AQPs家族中的AQP3高表達，臨床病理分析表明AQP3 可能參與NSCLC的血管生成。

惡性腫瘤基本的生物學特征為腫瘤細胞的無限增殖和分化異常。為滿足快速增殖、分裂和侵襲轉移的需要，腫瘤細胞比正常細胞更需要水分子的快速跨膜轉運。多數惡性腫瘤有很高的組織間隙液體壓力和微血管滲透性，細胞內外滲透壓變化頻率加快，這在腫瘤的侵襲和轉移中具有重要作用[7]。AQP3表達或功能的改變不僅對水分子的運輸產生明顯影響，而且對細胞的生命活動至關重要。有研究[8]表明敲除AQP3基因，小鼠內皮細胞遷移速度明顯降低，從而引起腫瘤血管生成障礙，腫瘤生長受抑制，提示AQP3與腫瘤血管生成及腫瘤生長、擴散有關。AQP3可以通過兩種途徑間接刺激腫瘤血管增生：①它與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）起協同作用，使腫瘤血管具有很高的通透性，并且加強纖維素外滲，加強了內皮細胞的增殖和遷移，而這兩種細胞功能促進了腫瘤血管生成和發展；②AQP3介導的高滲透性引起流體靜力壓的增高，并且隨之引起缺氧，刺激血管生成[9]。

本研究對180例NSCLC標本進行了免疫組織化學分析；其中鱗癌64例，腺癌99例，大細胞癌10例，其它病理類型7例。研究發現，腺癌中AQP3強陽性率最高（65.7%），而鱗癌為35.9%，大細胞癌未檢測到AQP3強陽性表達。因此表明，AQP3在肺組織的表達不僅具有細胞特異性，而且還具有腫瘤組織類型特異性。另外，對NSCLC腫瘤分化程度與AQP3表達關系的研究表明，高分化癌組織AQP3表達較多，低分化癌表達少。由于不同類型肺癌在腫瘤演進過程中可能存在著不同機制，有研究[10]認為肺腺癌與肺鱗癌在生物學行為上的不同可能是基因表達上的差異。我們的研究發現AQP3的表達與臨床病理特征存在相關，因此認為AQP3表達的明顯差異可能是肺腺癌較鱗癌更容易轉移的原因。AQP3的表達可能與肺腺癌關系更密切。目前，腫瘤的微血管密度被用于提示腫瘤血管生成的數量，是衡量腫瘤血管形成程度的定量指標，可以提示腫瘤的復發、轉移潛能以及遠期生存率，并被認為與腫瘤的生長、轉移及預后有著密切的關系[11]。本研究發現，CD34不同程度地表達于NSCLC及癌旁正常組織，兩組之間的差異明顯，相關性分析表明AQP3與MVD在NSCLC組織中的表達呈正相關（P＜0.01），說明AQP3在NSCLC的新生血管形成過程中起著非常重要的作用，而在腫瘤的生長、轉移過程中，血管的生成又為其提供了必須的物質基礎和轉移通道[12]。

本研究還發現，男性患者AQP3表達高于女性患者（P=0.003）。在有淋巴結轉移的病例中存在AQP3高表達（P=0.026）。NSCLC中AQP3的陽性率與腫瘤分化程度呈明顯正相關，表現為AQP3的陽性率在高分化癌中明顯高于低分化癌（P＜0.001）。但AQP3的表達情況與年齡、病理分級等無相關性（P＞0.05）。既往研究[13]發現AQP3作為水通道中的水甘油通道參與一系列重要的物質代謝過程，在維持細胞的能量平衡中起一定作用，從而推測腫瘤細胞的能量供應、生物大分子合成等生理活動均有AQP3參與。有報道[14]提示，野生型小鼠與AQP3基因敲除小鼠相比，更易患腫瘤，因為AQP3缺失的小鼠的表皮細胞中甘油、3-磷酸甘油及ATP含量下降，從而使細胞增殖能力下降，減少了腫瘤發生的可能，以上研究均支持AQP3在腫瘤細胞增殖轉移過程能量供應方面發揮了重要的作用。

綜上所述，本研究表明，AQP3高表達與肺癌病理組織學類型、腫瘤分化程度、腫瘤性血管新生、淋巴結轉移等臨床特征相關。AQP3在NSCLC中的高表達可能對腫瘤血管生成起到了促進和維持的作用。因此，對AQP3的研究有助于理解肺癌組織中水電解質平衡的復雜過程，其確切機制有待于進一步研究。