MACC1和c-met在非小細胞肺癌中的表達及其預后價值

胡興勝 付曦 文世民 鄒心怡 劉雨松

目前，肺癌死亡率已位居男、女性惡性腫瘤的第一位[1]，全球每年至少有160萬的新發病例和130萬的死亡病例。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數的80%。侵潤和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征之一，亦是導致患者死亡的主要原因。肺癌易發生浸潤和轉移，其5年生存率低。目前有關肺癌浸潤轉移的機制尚不完全清楚，因此探索與肺癌浸潤轉移尤其是與預后相關的生物學指標，顯得尤為重要。研究[2]表明，結腸癌轉移相關基因1（metastasis-associated in colon cancer 1, MACC1）是2009年新發現的，能夠預測腫瘤浸潤轉移及預后的新基因，其機制可能與調節肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF，又稱離散因子）及其受體c-met表達有關。為此，我們采用免疫組化聯合檢測了MACC1和c-met在NSCLC組織中的表達情況，并分析了它們與肺癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2003年1月-2006年1月在川北醫學院第二臨床學院胸心外科手術標本103例和同期40例距離癌腫邊緣5 cm以上的正常組織。所有患者術前均未化療或放療，有完整的臨床資料和明確的術后病理診斷。其中男性77例，女性26例；＜60歲51例，≥60歲52例；不吸煙42例，吸煙61例；鱗癌56例，腺癌47例；高分化15例，中分化68例，低分化20例；T1期+T2期78例，T3期+T4期25例；N0期70例，N1,2,3期33例；I期56例，II期12例，III期35例。

隨訪：所有患者每3個月均進行電話、門診或住院部隨訪，隨訪開始于2003年4月，2011年1月結束，最短隨訪時間為4個月，最長隨訪時間為5年。期間有9例失訪。

1.2 免疫組化檢測MACC1和c-met蛋白的表達 手術標本經10%甲醛固定后，常規石蠟包埋、切片，厚度4 μm。采用免疫組化SP法（兔抗人MACC1多克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗人c-met多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化二抗SP試劑盒購自北京中杉生物公司）。用PBS液代替一抗作為陰性對照，按照試劑說明書進行操作。結果判斷：所有切片均采用雙盲法由兩位病理科醫師獨立閱片。MACC1和c-met陽性表達均定位于細胞漿和細胞膜，呈淺黃色、黃色或棕黃色。隨機選擇10個高倍鏡視野（400倍），每個視野連續計數100個細胞，共計數1,000個細胞。最后表達以染色強度和陽性細胞率的得分之和進行判斷：無染色記0分，弱染色記1分，中等染色記2分，強染色記3分；陽性細胞率＜5%記0分，5%-25%記1分，26%-50%記2分，＞50%記3分。上述兩項評分相加，＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件包分析。率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗，多因素生存分析采用Cox多因素分析模型，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MACC1和c-met蛋白檢測結果 MACC1和c-met在癌組中的陽性率分別為67.9%（70/103）和68.9%（71/103），均明顯高于其在正常組織中的表達5.0%（2/40）（χ2=45.684, P＜0.001）和7.5%（3/40）（χ2=43.545, P＜0.001）（圖1）。

2.2 MACC1蛋白表達與肺癌臨床病理特征的聯系 統計學結果顯示，MACC1和c-met的陽性率均隨腫瘤分化程度的降低、T分期的增加、淋巴結轉移和TNM分期的增加而增加（P＜0.05），而與性別、年齡、吸煙及組織學類型等無關（P＞0.05）（表1）。

2.3 MACC1和c-met相關性分析 經Spearman秩相關分析發現，在103例肺癌組織中MACC1和c-met的表達呈正相關，（r=0.403, P＜0.001）。

2.4 生存分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示，MACC1陽性組的5年生存率為19.5%，明顯低于陰性組的59.9%（χ2=15.093, P＜0.001）。c-met陽性組5年生存率為25.4%，明顯低于陰性組的48.3%（χ2=8.230, P=0.004）（圖2）。

2.5 Cox多因素回歸分析 Kaplan-Meier單因素分析發現，分化程度、T分期、淋巴結轉移、TNM分期均與患者的生存期相關，故均納入Cox多因素分析模型。Cox多因素分析結果顯示，只有MACC1（P=0.026）和TNM分期（P=0.004）是肺癌患者的獨立預后危險因素，其相對危險度（relative risk, RR）分別為2.178（95%CI:1.097-4.327）和2.230（95%CI: 1.288-3.860），而c-met表達不是患者的獨立危險因素（P＞0.05）（表2）。

3 討論

MACC1基因定位于人染色體7p21.1。該基因是2009年由Stein等[2]發現并命名的一個新基因，研究表明它與結腸癌的浸潤、轉移及預后密切相關。Stein檢測到MACC1在結腸癌組織中表達異常增高，在有遠處轉移病例中其表達明顯高于無轉移者，MACC1高表達者5年生存率為15%明顯低于低表達者的80%，且是結腸癌轉移的獨立預后指標。后來研究表明，MACC1在胃癌[3]、肝癌[4-5]、卵巢癌[6]、肺腺癌[7]、前列腺癌[8]等腺癌組織及膀胱移行細胞癌[9]、腦膠質瘤[10]、小細胞肺癌細胞系[11]等非腺癌組織中過表達，并且與浸潤轉移密切相關。MACC1高表達的肝癌組患者總生存率和無病生存率均明顯低于低表達組[5]。在肺癌的研究中，Chundong等[7]采用免疫組化方法對197例手術后肺腺癌患者研究結果顯示，MACC1的陽性率為65.5%，在復發組中的陽性率為82.5%（33/40），明顯高于非復發組的61.1%（96/157），陽性組無病生存期較陰性組降低。楊淑慧等[11]觀察到MACC1在小細胞肺癌細胞系中高表達，用MACC1 siRNA抑制其表達后，能明顯抑制癌細胞的增殖遷移能力。

圖 1 免疫組化檢測MACC1在肺鱗癌（A）和腺癌（B）以及c-met在肺鱗癌（C）和腺癌（D）組織中的陽性表達（×400）Fig 1 The positive expression of MACC1 in lung squamous carcinoma (A) and adenocarcinoma (B), c-met in lung squamous carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) tissue by immunohistochemistry (×400).

圖 2 Kaplan-Meier累計生存時間曲線分析。A：MACC1表達陽性和陰性NSCLC患者；B：c-met表達陽性和陰性NSCLC患者。Fig 2 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A: MACC1 positive and negative expression group of NSCLC petients; B: c-met positive and negative expression group of NSCLC petients; NSCLC:non-small cell lung cancer.

HGF是一種多功能細胞活性因子，具有很強的促有絲分裂作用，可誘導上皮細胞和成纖維細胞發生離散和運動。c-met是由原癌基因編碼的HGF受體，主要在各種上皮細胞中表達。c-met編碼了酪氨酸激酶，可調節腫瘤細胞侵襲性生長。HGF須與c-met受體結合方能發揮作用，兩者結合導致兩個酪氨酸殘端在羧基端的磷酸化，引起一系列信號轉導蛋白的酶促反應，從而調節相應的生物學行為，如細胞的運動等。正常的HGF/c-met通路在調節胚胎發育及組織損傷修復，而異常激活促進腫瘤的轉移。HGF/c-met在多種惡性腫瘤組織中異常表達，并且與腫瘤的進展密切相關[12,13]。

MACC1是HGF/c-met信號通路的一個關鍵調節因子。c-met已被證明是MACC1的轉錄子靶點[2]，它能通過擴增和（或）變異而不依賴與HGF的結合來激活。MACC1調節c-met的機制，可能是與c-met啟動子區的SP1位點結合，從而激活c-met，促進其轉錄。HGF與c-met結合后，能啟動下游3條信號途徑：①磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）；②信號轉導及轉錄激活因子（STAT）；③有絲分裂原活化激酶（MAPK）。這3條通路是細胞核內主要轉錄機構，從而促使腫瘤細胞增殖、運動、浸潤、轉移及血管生成等。另外，MACC1還可通過促進細胞外基質的降解、調節細胞骨架的結構[8]等方面，促進腫瘤的浸潤和轉移。

表 1 MACC1和c-met的表達與NSCLC的臨床病理特征聯系Tab 1 Correlation of MACC1 and c-met expression with clinicopathologic characteristics of NSCLC

表 2 Cox方程中的變量Tab 2 Cox variables in the Equation

本研究結果顯示，MACC1和c-met蛋白均在NSCLC組織中呈過表達。雖然文獻多數報道MACC1在腺癌中高表達，但本研究首次報道了其在鱗癌組織中的高表達，與腺癌組織中的表達無統計學差異，這可能與MACC1（與c-met相關）在腫瘤的發展過程中普遍起作用相關，這已在膀胱癌[9]、腦膠質瘤[10]、小細胞肺癌細胞系[11]非腺癌中得到證實。本研究表明，MACC1和c-met蛋白的異常表達均與肺癌的分化程度、T分期、淋巴結轉移和TNM分期密切相關，與文獻報道基本一致。T分期是腫瘤體積的大小和侵襲能力的綜合反應，提示MACC1參與了腫瘤的分化、增殖、侵襲和轉移等。本研究中MACC1和c-met的表達呈正相關（r=0.403, P＜0.001），與Zhang[6]在卵巢癌中的報道（r=0.429, P=0.002）基本一致，但高于Qiu[5]在肝癌中對兩者mRNA檢測的報道（r=0.235, P=0.009），導致這種差異可能與腫瘤的類型、蛋白/mRNA檢測的差異及樣本量有關。本研究生存分析顯示，MACC1和c-met的高表達均預示肺癌的不良預后，其中MACC1是肺癌獨立預后危險因素，這與Stein[2]在結腸癌、Qiu[5]在肝癌及Chundong[7]在肺腺癌中的報道基本一致，提示MACC1可能是腫瘤的一個重要獨立預后分子指標。

綜上所述，我們的研究揭示了MACC1和c-met均在肺癌組織中過表達，其表達與肺癌的分化、浸潤轉移相關，它們對生存期均有一定的影響，而MACC1可能是肺癌的一項新的獨立預后指標。因此，通過檢測MACC1和c-met的表達可以更好的判斷肺癌的惡性程度和預后，設想通過抑制MACC1的表達，抑制腫瘤浸潤轉移等，改善肺癌的不良預后，為腫瘤的靶向治療提供新的靶點，為腫瘤發病機制的研究提供新的思路。