抗保幼激素調控家蠶發育相關血液蛋白質組的初步分析

王廷良 吳志平，2 鄭必平 談建中，3

(1蘇州大學建筑與城市環境學院，江蘇蘇州 215123; 2江蘇華佳絲綢有限公司，江蘇吳江 215227;3蘇州大學蠶桑研究所，江蘇蘇州 215123)

家蠶幼蟲期的生長發育主要受蛻皮激素和保幼激素的調節控制［1］，咽側體分泌的保幼激素主要是維持幼蟲形態，阻止幼蟲變態發育，而前胸腺分泌的蛻皮激素則是促進幼蟲蛻皮和變態，家蠶每個齡期的生長發育狀態主要由這2種激素的相對濃度決定［2－3］。為了提高蠶絲經濟產量或應用價值，許多學者就外源性保幼激素、蛻皮激素和抗保幼激素等在家蠶上的應用進行了探索，以期通過調控家蠶生長發育來生產超細纖度或超粗纖度的生絲，開拓蠶絲新用途［4－6］。

抗保幼激素(Anti-juvenile hormone，AJH)是一類能引起家蠶早熟變態的咪唑類化學物質，在家蠶幼蟲的2齡、3齡或4齡的早期使用這類化合物，均能誘導家蠶早熟變態獲得三眠蠶，生產細纖度的繭絲［7－8］。其誘導三眠蠶的作用機理在于抑制了咽側體產生保幼激素或作為阻礙劑來阻止保幼激素生物合成，或是抑制了前胸腺的活性，使體液中蛻皮激素滴度峰延遲呈現，從而表現變態蛻皮［9－10］。本試驗應用金鹿三眠素處理4齡餉食家蠶，用十二烷基硫酸納－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和質譜技術，就AJH處理后家蠶血液中差異表達的蛋白質組分進行了分析與鑒定，以期在蛋白質水平上研究抗保幼激素對家蠶發育調控的作用機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蠶品種:大造，二化性品種，由蘇州大學蠶桑研究所司馬楊虎教授提供;抗保幼激素:金鹿三眠素，由浙江大學動物科學學院陸雪芳教授提供。

1.2 三眠蠶的誘導方法

供試家蠶品種大造在1～3齡期間按常規方法飼養，4齡餉食時分區處理。試驗設金鹿三眠素處理組(A)、清水對照組(CK)。抗保幼激素處理時，首先將金鹿三眠素配成質量濃度為400 g/L的水溶液，用噴霧器均勻噴濕桑葉的正反兩面，稍晾干后于4齡餉食開始給桑，連續添食2 d。對照區用清水處理過的桑葉，連續添食2 d。添食結束后，改用常規桑葉(片葉)飼養，金鹿三眠素誘導處理組的三眠蠶率平均可達96%。

1.3 家蠶血液的采集

金鹿三眠素處理組于4齡餉食后48、72、96、120、144、168 h，清水對照組于 4 齡餉食后 48、72 h、熟蠶期等不同發育階段分別采集雌蠶血液，并置于－70℃冰箱中保存備用。

1.4 血液蛋白質的提取

參照文獻［11］的方法提取和定量分析家蠶血液蛋白質:取上述不同時期金鹿三眠素處理組和清水對照組的雌蠶血液，加入2.5倍體積的樣品緩沖液(6 mol·L－1Urea、2 mol·L－1Thiourea、2%CHAPS、15 mmol·L－1DTT)，加液氮研磨，使血細胞充分破碎，待溶解后于4℃、14 000 r/min條件下離心20 min;棄沉淀，取上清，于4℃、14 000 r/min條件下離心30 min;取上清，加3倍丙酮在－20℃下沉淀過夜;沉淀加樣品緩沖液重懸后，取上清液蛋白質樣品用Bradford法［11］測定蛋白質濃度，然后分裝保存于－70℃備用。

1.5 血液蛋白質的SDS-PAGE

按照參考文獻［12］的方法，配制丙烯酰胺濃度(體積比)分別為12%的分離膠和5%的濃縮膠;分別取金鹿三眠素處理組、清水對照組血液蛋白等量樣品50μg進行SDS-PAGE;上樣后，用恒定電流進行電泳，當溴酚藍指示劑到達凝膠底部時停止電泳;電泳結束后，采用考馬斯亮藍染色2 h后，用脫色液脫色過夜，用掃描儀高精度掃描和比較凝膠圖譜后，將凝膠置于潔凈玻璃板上，切取差異性條帶用于質譜分析［13］。

1.6 蛋白質膠內酶切與質譜分析

選取差異表達蛋白質條帶，委托上海新科生命生物科技公司進行膠內酶切及質譜分析。

2 結果與分析

2.1 抗保幼激素誘導相關血液蛋白質的SDSPAGE分析

對金鹿三眠素處理組不同發育時期的血液蛋白質進行了SDS-PAGE分析，結果如圖1所示，4齡餉食開始連續添食抗保幼激素后，檢測到蛋白質群a(70 kD左右)與蛋白質群c(30 kD左右)的表達量逐漸增加，之后含量都維持在較高的水平，其中30 kD左右蛋白質組分的表達量最為豐富，70 kD蛋白質組分次之，而蛋白質群b的表達量則逐漸降低。其次，在4齡餉食后72 h(AH2)與48 h(AH1)之間檢測到了明顯差異表達蛋白的條帶，從72 h開始出現了條帶S1和S2，直到熟蠶時都保持著很高的表達量，但條帶S4在72 h后開始消失。

圖1 金鹿三眠素誘導處理后4齡蠶血液蛋白質的SDS-PAGE圖譜

2.2 抗保幼激素誘導處理組與對照組血液蛋白質SDS-PAGE比較分析

在上述分析的基礎上，選取幾個特殊發育階段的血液蛋白質進行SDS-PAGE分析，結果在用抗保幼激素(金鹿三眠素)誘導處理組與對照組之間檢測到了發育相關的差異表達蛋白 S1、S2、S3和S4(圖2)。其中，條帶S1和S2在處理組72 h(AH2)時開始出現，一直到熟蠶期都大量積累，而對照組在4齡期不存在這2個條帶，直到熟蠶期才檢測到大量積累。相似地，金鹿三眠素誘導處理組條帶S3的表達量也高于對照組。其次，金鹿三眠素誘導處理組條帶S4在72 h時(AH2)消失，而對照組(CH1、CH2)中條帶S4比較明顯，暗示差異條帶S4可能含有與維持幼蟲形態有關的蛋白質組分，而差異條帶S1、S2、S3可能含有與家蠶變態發育(老熟結繭)調控有關的蛋白質組分。

圖2 金鹿三眠素誘導處理組與對照組血液蛋白質SDS-PAGE分析圖譜

2.3 抗保幼激素誘導處理組與對照組血液蛋白質差異條帶的MS分析

為研究三眠蠶血液差異性條帶的蛋白質組分，從圖2的1DE凝膠上切取條帶S1、S2和S4(因S1、S2、和S3條帶相距太近，為便于切膠操作，明確區分條帶，故未取條帶S3)，經膠內酶切、質譜鑒定及Mascot檢索進行分析，結果共獲得了82個相匹配的候選蛋白質，剔除覆蓋率較低(小于15%)的組分后，鑒定了其中的26個蛋白質組分，鑒定結果如表1。

表1 三眠蠶血液差異蛋白質條帶的MS/MS鑒定結果

在差異條帶S1、S2中，鑒定得到了多種與生理代謝相關的功能蛋白質，其中30 kD蛋白家族的組分最多(表1)。業已清楚，大部分的30 kD蛋白基因活性從5齡第3天開始上升，5齡第4天到吐絲期活性持續提高，隨后迅速下降，化蛹時完全消失，其功能可能涉及到脂肪酸的轉運、胚胎發育、細胞程序化死亡及血漿天然免疫反應等［14］。另一組分家蠶幼蟲血清蛋白BmLSP，分子質量約為30 kD，具有免疫、轉運與貯藏等生理功能，具有發育與組織特異性表達的特征［15］。本研究在家蠶4齡餉食時開始用抗保幼激素金鹿三眠素進行誘導處理，結果在4齡第3天(72 h)即檢測到了30 kD蛋白的大量表達，而對照組此時未見明顯變化。

保幼激素結合蛋白(Juvenile hormone binding protein)是存在于血淋巴和細胞內的一種特異載體蛋白，與保幼激素結合后保護保幼激素不被酶降解，并將它運送到作用部位，參與家蠶發育的調控過程［16］。芳基貯存蛋白(Arylphorin)是一種富含苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸的蛋白［16］，在幼蟲攝食期的脂肪體中合成旺盛，分泌到血液中，化蛹時，又幾乎全部再被脂肪體攝取并積聚于脂肪體細胞的蛋白質顆粒中，其主要功能是在幼蟲蛻皮及變態中作為主要的氨基酸供源，用于體內組織的形成和生殖的需要［17］。

熱激蛋白25.4屬于小熱休克蛋白家族，小分子熱休克蛋白的主要功能是與其他蛋白進行相互作用，從而使信號轉導、新陳代謝、轉錄、翻譯等生命過程中的各種細胞蛋白保持穩定。前人研究發現熱休克蛋白25.4主要存在于家蠶5齡幼蟲脂肪體和血液組織中［18］，本試驗在抗保幼激素金鹿三眠素誘導處理組4齡蠶的血液蛋白質中就已檢測到了熱休克蛋白25.4，說明用抗保幼激素處理的家蠶表現出了5齡期的性狀。

從條帶S4中鑒定得到的蛋白質還包括了溶酶體硫醇還原酶IP30前體1型和2型，家蠶中有關這種酶的研究目前還比較少，蔡克亞等［19］分析了家蠶抗核型多角體病毒(BmNPV)抗性品系與感性品系血淋巴液蛋白質組的差異，發現溶酶體硫醇還原酶IP30前體1型存在于感性品種中，而在高抗品系中沒有檢測到。本試驗中發現用抗保幼激素處理過的家蠶，S4條帶在處理后72 h消失，但對其功能了解尚少。

此外，從家蠶血液總蛋白中還鑒定到了其他14種蛋白(覆蓋率小于15%)，推測這些蛋白的表達量相對較低。如胰凝乳蛋白酶抑制劑(Chymotrypsin inhibitor CI-8A)、14-3-3 ε 蛋白(14-3-3 epsilon protein)、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-活化蛋白 ε多肽(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein epsilon polypeptide)、性別特異性儲藏蛋白SP1(Sex-specific storage-protein SP1)、絲氨酸蛋白酶前體(Serine protease precursor)、類絲氨酸蛋白酶(Scolexin)、類幾丁質 EN03(Chitinase-like protein EN03)、成蟲原基生長因子(Imaginal disk growth factor)、類 IDGF蛋白(IDGF like protein)、圍脂滴蛋白(Perilipin)、轉鐵蛋白(Transferrin)、同源異型盒蛋白(Homeobox protein)、突觸融合蛋白(Syntaxin)、線粒體磷酸烯醇式羧激酶亞型2(Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase isoform 2)，這些蛋白質分別參與了不同的生理代謝。如胰凝乳蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的一種，在家蠶體內主要對蛋白酶的活性進行調控，維持昆蟲正常的生理功能［20］;類絲氨酸蛋白酶是一種昆蟲免疫蛋白，為應對外來細菌或病毒的入侵而在體內產生的一種能引起凝血的血漿蛋白［21］;圍脂滴蛋白是脂滴相關蛋白家族的核心成員之一，是定位于脂滴表面的高磷酸化蛋白，對脂肪組織中甘油三脂代謝有雙重調節作用［22］;轉鐵蛋白是控制生物體液中自由鐵含量的鐵結合血漿糖蛋白［23］;突觸融合蛋白是參與胞吐作用的一組細胞膜結合Q-SNARE蛋白的蛋白質家族［24］。

3 討論

用抗保幼激素類藥物處理家蠶，可使普通四眠蠶變為三眠蠶。吳金美等［25］研究認為，KK-42應用于家蠶4齡前期時，靶細胞器官首先是咽側體，咽側體合成活性的變化反饋到腦，使腦分泌的PTTH發生相應變化，使得抗保幼激素處理組第3天家蠶體內蛻皮激素的濃度降低，促使蛻皮激素高峰的延遲，而對照組此時的蛻皮激素濃度維持在一個較高的濃度。由于蛻皮激素峰值的延遲、同時保幼激素相對饋乏，兩者共同作用引起了家蠶化蛹蛻皮，從而由四眠蠶形成三眠蠶。

本試驗用抗保幼激素類物(金鹿三眠素)在4齡餉食后48 h內對家蠶品種大造進行處理，應用單向凝膠電泳與質譜技術，分析了抗保幼激素作用相關的差異蛋白質組分，結果從血液蛋白質的SDSPAGE中檢測到了差異表達的蛋白質，對具有表達差異蛋白條帶進行了質譜鑒定，結果檢測到了多種30 kD蛋白組分。一般認為，家蠶從蟻蠶至4齡末期的血液中都檢測不到30 kD蛋白的表達，大部分的30 kD蛋白基因活性從5齡第3天開始上升，5齡第4天開始到吐絲期活性持續提高，隨后迅速下降，化蛹時完全消失［14］。通過手術摘除家蠶幼蟲咽側體，家蠶血漿中30 kD蛋白的表達量會迅速上升［14］;隨著5齡初期家蠶體內保幼激素濃度的下降，30 kD蛋白在血漿中的濃度確有升高，由此認為，30 kD蛋白在脂肪體內的生物合成可能受到保幼激素的影響［14］。

本研究在家蠶4齡餉食時開始用抗保幼激素進行處理，在4齡第3天(72 h)即檢測到了30 kD蛋白的大量表達，而對照組此時未見明顯變化，推測用抗保幼激素處理4齡家蠶可能抑制了咽側體分泌保幼激素，使保幼激素濃度進入一個低水平時期，提前啟動了30 kD蛋白相關基因的表達，從而使家蠶進入變態發育階段。據此推測，30 kD蛋白可以為研究保幼激素調控基因表達提供一個模式系統。

條帶S1中還含有家蠶幼蟲血清蛋白BmLSP，分子質量約為30 kD，在幼蟲脂肪體細胞內合成，具有組織特異性，以及免疫、轉運與貯藏等生理功能。免疫和轉運功能的血清蛋白在發育過程中維持恒定的水平，而作為貯藏功能的血清蛋白隨著發育階段不同呈現有規律的變化，為昆蟲蛻皮或變態提供能量或原料［15］。研究發現，BmLSP從蟻蠶開始至5齡第3天之前各個齡期食桑階段均有轉錄表達，每個齡期的初期表達量較高，在4齡眠中有微弱表達，5齡餉食后BmLSP mRNA雖有轉錄，但是轉錄水平急劇下降，到第3天已檢測不出，熟蠶時完全消失，在蛹期和成蟲期也未檢測到BmLSP mRNA［15］。本研究用抗保幼激素處理后，在4齡第3天(72 h)仍檢測到BmLSP的表達，這與JH在幼蟲5齡初期的表達變化相似，推測BmLSP可能是承擔保幼功能蛋白質中的一員［26］，但對其誘導家蠶早熟變態的具體作用機理還有待進一步研究。

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