多西他賽與吉非替尼序貫應用對人肺腺癌細胞H1975存活及凋亡通路的研究

張鑫宇 劉皈陽 祝曉光 王偉蘭

肺癌是當今發生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，依據患者的臨床和病理特征，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），二者中NSCLC占80.4%。由于大部分肺癌患者被診斷發現時已屬于晚期，導致患者的5年生存率往往低于10%[1]。

近年來鉑類為主的傳統的兩藥聯合化療方案的療效遇到瓶頸[2,3]，以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）為靶點的分子靶向治療成為腫瘤治療研究的熱點。吉非替尼和厄洛替尼是具有口服活性可逆的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs），在胞內和ATP競爭酪氨酸激酶殘基的結合位點，阻止酪氨酸激酶殘基自身磷酸化而抑制下游信號的轉導，最終加速細胞凋亡[4]，被廣泛應用于晚期進展的NSCLC。然而臨床實驗和臨床觀察中發現EGFR-TKIs并不適用于所有患者，2004年幾項重要的回顧性研究[5-7]發現占EGFR 90%以上突變比例的19和21外顯子的突變可預測EGFR-TKIs的敏感性。優勢突變人群的臨床特征主要表現為亞裔、非吸煙的女性患者。2009年3項大型前瞻性的III期臨床實驗[8-10]進一步證實了上述結論，基于此，2010年NCCN（中國版）指南要求晚期進展的NSCLC患者在使用EGFR-TKIs時要進行EGFR突變檢測。雖然EGFR-TKIs在攜帶優勢突變的患者身上顯示出較好的反應率，但獲得性耐藥卻不可避免地尾隨而至，一般出現在最初治療10個月后[11]。獲得性耐藥的可能機制有很多，主要包括EGFR 20外顯子T790M突變[12]；肝細胞生長因子受體（mesenchymal-epithelial transition factor,Met）擴增[13]；肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）的高表達[14]；EGFR旁路信號通路胰島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF）受體的激活[15]；下游信號分子堿性磷脂酶（phosphatase and tensin homolog,PTEN）的缺失[16]以及最近發現的上皮間質化（epithelialto-mesenchymal transition, EMT）[17,18]。其中T790M突變約占上述總比例的50%以上，為當下研究的熱點。從發現耐藥以來，逆轉耐藥的研究也一直沒有停止過。根據TKIs治療失敗的分子機制研究主要有靶向T790M耐藥突變開發的新一代不可逆的TKIs、選擇性c-met擴增抑制劑、拮抗IGF1-R的單克隆抗體以及針對EMT耐藥設計的抑制劑，均取得較好的初步結果。遺憾的是研究成果大多處于II期、III期臨床試驗中[19]，真正走向臨床服務于患者還需要一個過程。這段時間中，面對越來越多TKIs治療失敗后仍需治療或仍有強烈治療意愿的患者，需要在已有的治療藥物基礎上探索新的治療模式，既往相關基礎研究發現合理的化療聯合靶向治療模式在NSCLC EGFR突變野生型和敏感型細胞株中均顯示有協同作用[20,21]。已有臨床醫生根據TKIs治療階段以及治療過程中患者對TKIs的反應，借助臨床現有的藥物和治療手段，不斷地嘗試逆轉耐藥，主要嘗試過鉑類聯合紫杉類化療、化療聯合靶向治療、化療后序貫原靶向治療以及更換另外一種TKIs等模式。雖然大都為小規模嘗試治療的總結，證據級別不高，但經驗可貴，值得借鑒[22-24]。

基于上述信息，我們發現在占獲得性耐藥比例最高的T790M突變人群中，有關化療與靶向藥物聯合應用的研究仍然不是很全面，本文通過體外實驗探索化療藥物多西他賽和吉非替尼在攜帶T790M突變的NSCLC獲得性耐藥細胞株H1975上合理的給藥模式，一方面進一步完善此方向研究，另一方面為T790M獲得性耐藥的后續治療提供一些值得借鑒的基礎理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞H1975購自中科院上海細胞生物研究所，由本實驗室保種。MTT、DMSO、吉非替尼購自Sigma公司。多西他賽由法國賽諾菲安萬特公司提供，吉非替尼與多西他賽均溶于DMSO中，分別以40 mmol/L與12 mmol/L過濾分裝后于-20oC保存，實驗時利用完全培養基稀釋到相應的工作濃度，且保證工作液中DMSO濃度不高于0.1%，每支藥物反復凍融不超過5次。凋亡細胞染色試劑盒購自普利萊基因技術有限公司，Annexinv-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，DNA含量（細胞周期）檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性檢測試劑盒購自R&D Systems。流式細胞儀為BD公司產品，酶聯免疫檢測儀為Biocell 2010公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肺腺癌細胞H1975培養于含10%胎牛血清和青霉素與鏈霉素（終濃度為100 U/mL）的RPMI-1640（Gibco公司）培養液，常規置于37oC、5%CO2培養箱中，細胞單層貼壁生長，實驗取用生長狀態良好的對數生長期細胞，胰蛋白酶消化傳代，收集備用。

1.2.2 MTT法檢測藥物對H1975生長作用的影響 通常認為在MTT檢測中空白對照組在波長570 nm的吸光度為0.8-1.2時，不同抑制組與空白組間區分效果較好，而吸光度與實驗中參與MTT代謝的細胞數量和活性相關，不同的腫瘤細胞增殖速度不同，由上述方法確定H1975的鋪板數為5,000個/孔。

1.2.2.1 單藥MTT實驗 實驗前一天晚上取生長狀態良好的對數生長期細胞，胰酶消化計數后完全培養基稀釋到上述相應濃度后，取100 μL到96孔板，37oC、5%CO2培養箱中孵育過夜，待細胞完全貼壁后，吸棄原培養基，加入200 μL完全培養基配置好的含不同藥物不同濃度的藥液，每個濃度至少6個復孔，設置空白組和對照組?？瞻捉M只加培養液，對照組不加藥物。培養72 h后每孔加用PBS配成的5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h-6 h后小心吸棄上清，每孔加150 μL DMSO，置水平搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，570 nm波長處測量各孔吸光度。分別計算各加藥組的抑制率。所有細胞增殖抑制實驗均獨立重復至少3次，求得平均抑制率，細胞存活率=（A用藥組/A對照組）×100%，細胞抑制率=（1-A用藥組/A對照組）×100%。

1.2.2.2 不同時序給藥方案的增殖抑制實驗 時序方案分組如下：①多西他賽作用24 h，PBS洗滌1遍，吉非替尼繼續序貫48 h（DG）；②多西他賽聯合吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1遍，不含藥液的完全培養基繼續孵育24 h（D+G）；③吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1遍，多西他賽繼續序貫24 h（GD）。不同時序方案下的兩藥給藥濃度根據上述單藥MTT的IC50值的比率進行確定，兩藥在每種方案下的給藥配比劑量分別為各自單藥IC50的0倍、0.25倍、0.5倍、1倍、2倍、4倍。MTT方法同上述單藥實驗。

1.2.3 兩藥時序使用效應的評估

1.2.3.1 Isobolograms等效線圖法 通過Steel和Peckham[25]的isobolograms來評價IC80（抑制80%細胞生長的藥物濃度）水平吉非替尼和多西他賽在H1975細胞株上的量效關系（圖1）。Isobolograms法是判定聯合用藥體外發生協同、相加、拮抗作用的標準統計方法，適用于毒性機制不明以及多種抗癌因子聯合作用下的量效曲線研究。Isobolograms的概念在先前的研究中有過詳細的描述[26]。

三條模型線由模型I、模型II圍成一個區域，以吉非替尼和多西他賽的療效曲線為基礎，圖中三條等效線圍成的陰影區域為相加作用，當Pa落在此區域的左邊時，則存在協同作用；當Pb落在陰影區域時則存在相加作用；當Pc、Pd落在此區域右邊時，則存在弱相加作用或拮抗作用。需要指出的是，在大多數情況下，以上4個點都同時落在三條模型線圍成的區域的左邊或區域內或區域的右邊。少數情況下如果這4個點不是落在同一個區域內，則用Wilcoxon符號軼和檢驗進行統計，以判斷協同、相加或拮抗作用。

由等效線模型I（實線）和II（虛線）圍成的區域為相加作用區域，模型線由吉非替尼和多西他賽的量效曲線構成。在H1975細胞株的等效線圖中，橫坐標和縱坐標的數值1分別代表導致80%細胞生長抑制的吉非替尼或多西他賽單藥濃度。時序給藥點Pa、Pb、Pc以及Pd分別表示協同、相加、弱相加或拮抗作用。

1.2.3.2 聯合指數分析 以MTT法測得單藥不同藥物劑量的抑制率后可以得到細胞的劑量-效應曲線，采用CalcuSyn分析軟件計算聯合指數（combination index,CI）。聯合指數的公式為CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(D)1、(D)2分別為聯合用藥時兩藥各自的濃度，Dx為聯合用藥達fa時單藥抑制率也達到fa所需要的藥物濃度，Dx=Dm[fa/(1-fa)]1/m，fa表示一定濃度的兩藥聯合用藥達到的抑制率。通過軟件輸入單藥的劑量及抑制率可得到Dm值和m值，再經上述聯合指數計算公式就可得到某種聯合用藥方案的效應，CI＜1表示此方案具有協同效應[27]。

1.2.4 流式細胞儀AnnexinV/7-AAD雙染色法檢測不同給藥方案下H1975細胞凋亡情況 實驗前一天晚上取生長狀態良好的對數生長期細胞，胰酶消化計數后完全培養基稀釋到1×106個/mL，取500 μL到25 cm培養瓶中，加完全培養基至5 mL，37oC、5%CO2培養箱中孵育過夜，待細胞完全貼壁后，吸棄原培養基，加入5 mL完全培養基配置好的含不同藥物濃度的藥液。到達作用時間后，不含EDTA的胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，計數收集5×105個-1×106個細胞，加入500 μL-1,000 μL的Binding Buffer重懸細胞調整細胞濃度到1×106個/mL。從以上細胞懸液中吸取100 μL轉移到5 mL流式上樣管中，分別加入5 μL 7-AAD和PE-Annexin V染液，室溫避光反應至少15 min，最后向每支流式管中加入300 μL-400 μL Binding Buffer，1 h內上機檢測，激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=578 nm，PE-Annexin V建議使用FL2通道檢測，7-AAD建議使用FL3通道檢測。每次實驗均需在正常細胞組中設立3組對照：①不加染料組；②7-AAD單染組；③PE-Annexin V單染組。實驗重復3次。正常活細胞Annexin V、7-AAD均低染，凋亡細胞Annexin V高染、7-AAD低染，死亡細胞Annexin V、PI均高染，胞質自切細胞7-AAD高染，Annexin V低染。實驗分組如下：①對照（無藥物作用）72 h組（N）；②多西他賽單獨作用72 h組（D）；③吉非替尼單獨作用72 h組（G）；④多西他賽作用24 h，PBS洗滌1次后序貫吉非替尼48 h組（DG）；⑤多西他賽聯合吉非替尼48 h，PBS洗滌1次后序貫不含藥液的完全培養基繼續孵育24 h組（D+G）；⑥吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1次后序貫多西他賽24 h組（GD）。每種方案下的給藥劑量分別為MTT單藥實驗中的IC50。

1.2.5 Hoechst 33258 DNA染色檢測凋亡 實驗分組同上，收集各組細胞到1.5 mL EP管中，4%多聚甲醛重懸細胞沉淀固定，1,000 rpm低速離心，吸棄固定液，PBS洗滌1次，將少量細胞懸液滴到載玻片上，涂布，風干；使用配制好的Hoechst 33342工作液，重懸細胞，室溫孵育10 min以上；吸棄染色液，PBS洗滌1次，抗熒光淬滅封片劑封片。每組細胞至少涂片5張，每張細胞涂片在Olympus熒光顯微鏡200倍視野下觀察8個不同視野，實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測不同給藥方案下H1975細胞周期分布情況 實驗分組和給藥劑量同凋亡實驗，到達作用時間后，胰蛋白酶-EDTA消化液消化收集細胞，PBS洗滌細胞1次，計數調整細胞濃度為1×106個/mL，70%冰乙醇固定，4oC保存，染色前PBS洗去固定液，加100 μL RNaseA 37oC水浴30 min，再避光加入400 μL PI染液混勻，4oC避光30 min，上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光，檢測細胞周期分布。

1.2.7 Caspase活性檢測 實驗分組和給藥劑量同凋亡實驗，收集2×106個-6×106個細胞，PBS洗滌2次，加50 μL-150 μL冰冷的Lysis Buffer（25 μL/1×106細胞），冰上孵育10 min，離心10,000 g、3 min，將上清轉移至新的EP管，取少量上清（5 μL），Braford法測定其中的蛋白濃度；吸取50 μL含100 μg-200 μg蛋白裂解上清；如體積不足50 μL用Lysis Buffer補足至總體積50 μL，加入50 μL的2×Reaction Buffer（注意：使用前每50 μL 2×Reaction Buffer加入0.5 μL DTT，Reaction Buffer要一一對應）；根據實驗目的加入5 μL Caspase-3（DEVD-AFC）、Caspase-8（IETDAFC）或者Caspase-9 （LEHD-AFC），并于37oC避光孵育2 h。酶標儀λ=405 nm測定其吸光值。通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來確定凋亡誘導劑組Caspase的活化程度。同時設置空白組（50 μL Lysis Buffer+50 μL 2×Reaction Buffer+5 μL底物）以及不含底物的陰性組（50 μL含蛋白Lysis Buffer+50 μL 2×Reaction Buffer）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，各組間差異分析采用One-way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 單藥MTT對H1975生長的影響 吉非替尼和多西他賽作用72 h對H1975細胞抑制作用的IC50值分別為（10.31±1.05）μmol/L、（3.03±0.13）nmol/L，并且呈濃度依賴性抑制H1975的生長（圖2）。

2.2 不同時序給藥方案對H1975增殖抑制作用 根據吉非替尼和多西他賽單藥的MTT結果，近似取IC50的整數值，吉非替尼為10 μmol/L，多西他賽為3 nmol/L。按照上述設計的3種時序給藥方案和藥物配比劑量進行MTT試驗，得到的結果見圖3。其中A、B、C分別代表多西他賽序貫吉非替尼組、多西他賽聯合吉非替尼組以及吉非替尼序貫多西他賽組。

縱坐標顯示的是H1975的存活率，橫坐標對應的是多西他賽和吉非替尼的濃度配比。依據3種給藥模型中兩藥單藥量效曲線可進一步繪制IC80下不同方案等效線圖從而評價模型之間的優劣。同時可以進行3種模型聯合用藥指數CI的分析。

2.3 不同時序模型給藥方案效果的評價

2.3.1 等效線圖法 依據3種給藥模型中吉非替尼和多西他賽單藥量效曲線繪制IC80下3種方案的等效線圖模型（圖4）。同時進行3種模型聯合用藥指數CI的分析（表1）。圖4中A、B、C分別代表多西他賽24 h序貫吉非替尼組48 h、多西他賽聯合吉非替尼組48 h以及吉非替尼48 h序貫多西他賽24 h組的等效線圖，各圖中橫縱坐標數值1分別代表每種模型下吉非替尼或多西他賽單藥作用后的IC80值。A圖中固定吉非替尼劑量后，變換多西他賽的劑量得到的5個IC80等效點中3個點落在IC80等效口袋區域的左側，2個點處于等效區域的左側邊緣位置，說明多西他賽序貫吉非替尼組主要表示為協同作用或接近強相加作用。B圖中5個IC80等效點皆處于IC80等效口袋區域內，且大都處于區域靠右側位置，說明多西他賽聯合吉非替尼主要表示為相加作用。C圖中5個IC80等效點皆處于IC80等效區域右側且遠離等效區域，表示吉非替尼序貫多西他賽主要表示為拮抗作用。

2.3.2 中位線效應法 對3種給藥模型得到的原始數據按照聯合用藥指數法進行分析采用CalcuSyn軟件計算聯合用藥的CI值，具體結果見表1-表3。從CI的概念來講，CI＞1說明藥物間為拮抗作用，CI=1說明藥物間為相加作用，CI＜1說明藥物間為協同作用。CI值越小，協同的效應越強烈。在實際實驗中，通常認為CI＜0.3表示強烈協同效應，0.3≤CI＜0.7為中度協同效應，0.7≤CI＜1.0為較弱的協同效應。表1結果顯示大部分值小于1，在吉非替尼低劑量的組別中個別值接近1或略高于1，說明多西他賽序貫吉非替尼組主要表現為強協同或中度協同作用。表2結果顯示大部分值在1附近，在吉非替尼低劑量組別出現高于1的現象，說明多西他賽聯合吉非替尼主要表現為相加作用。表3結果顯示大部分值遠遠超過1，表示吉非替尼序貫多西他賽主要表現為拮抗作用。

圖1 等效線圖法的原理圖Fig 1 Schematic representation of an isobologram

圖2 不同濃度的吉非替尼（A）和多西他賽（B）作用72 h對H1975細胞生長的影響Fig 2 Effects of gefitinib (A) and docetaxel (B) on the proliferation of H1975 cells for 72 h

2.4 Annexin V/7-AAD雙染色法檢測吉非替尼和多西他賽誘導H1975細胞的凋亡 采用流式細胞儀分析方法進一步確定多西他賽序貫吉非替尼是否導致最高的凋亡率。共設計6種給藥方案，其中包括空白對照組以及多西他賽和吉非替尼單藥組（圖5A），結果發現與正常組相比，10 μmol吉非替尼單藥（7.69±0.48）以及吉非替尼序貫多西他賽（5.37±0.62）方案均未引起H1975出現明顯的凋亡現象，吉非替尼聯合多西他賽同吉非替尼單藥以及多西他賽序貫吉非替尼與空白組比較皆誘導產生明顯凋亡（P＜0.05），而且多西他賽單藥（25.54±1.27）與多西他賽序貫吉非替尼（27.36±0.72）方案較多西他賽聯合吉非替尼方案（14.75±1.14）在誘導凋亡結果上也具有明顯差異（P＜0.05）。但多西他賽單藥和多西他賽序貫吉非替尼兩種方案間未能得出有統計學意義的結果，數值上多西他賽序貫吉非替尼組略顯優勢（圖5B）。

2.5 藥物處理后Hoechest 33258染色結果 藥物誘導凋亡的H1975細胞，Hoechest 33258染色后顯示藍染的凋亡小體和細胞核。與完整、圓形、大型的細胞核相比，單個凋亡小體呈細小不規則顆粒狀，同一細胞內（紅色箭頭指示處）可出現大小不等的多個凋亡小體（圖5C）。

2.6 不同給藥方式對細胞周期的影響 給藥劑量和實驗分組同細胞凋亡實驗，不同作用方式下的結果都以正常組為基準進行比較，流式圖結果見圖6A，由統計結果可以看出，吉非替尼單藥主要將細胞抑制在G0/G1期（56.59±3.29）（P＜0.05），而單藥多西他賽作用后，G2/M期的細胞明顯增多（42.57±1.22）（P＜0.05），同樣在吉非替尼序貫多西他賽方案中G0/G1期細胞高達57.48±3.63（P＜0.05），而多西他賽序貫吉非替尼組G0/G1期細胞僅占36.5±2.65，G2/M期細胞比例則為39.83±1.28（P＜0.05）（圖6A）。由此可見吉非替尼單藥或吉非替尼序貫多西他賽組主要誘導G0/G1期阻滯，而多西他賽單藥或多西他賽序貫吉非替尼組主要誘導G2/M期阻滯。

2.7 不同給藥方式下Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性情況 由方法中可知Caspase的活化程度可以通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來確定。統計結果發現與其它組相比，多西他賽序貫吉非替尼組Caspase-3的活性為2.1±0.19（P＜0.05），多西他賽組Caspase-8的活性為2.59±0.27（P＜0.05），而所有組Caspase-9的活性沒有統計學差異（圖7）。

3 討論

圖3 吉非替尼和多西他賽在H1975細胞株中的時序依賴關系。A：多西他賽24 h后吉非替尼48 h；B：多西他賽聯合吉非替尼48 h序貫24 h不含藥完全培養基；C：吉非替尼48 h序貫多西他賽24 h?？v坐標代表細胞存活率，橫坐標代表多西他賽和吉非替尼濃度配比，濃度單位為μmol/L（□為0、○為2.5、Δ為5.0、＋為10、×為20、▽為40）。數據為3次獨立實驗的平均值；標準差＜20%。DG：多西他賽序貫吉非替尼；D+G：多西他賽聯合吉非替尼；GD：吉非替尼聯合多西他賽。Fig 3 Schedule dependence of the interaction between gefitinib and docetaxel in H1975. A: Pretreated with docetaxel 24 h, followed by gefitinib for 48 h;B: Treated concomitantly with gefitinib and docetaxel for 48 h and incubated in drug-free medium for 24 h; C: Pretreated with gefitinib 48 h, followed by docetaxel for 24 h. The survival rate are show on ordinate, the concentrations of docetaxel and gefitinib are shown on the abscissa. The concentrations unit is μmol/L. 0, squares; 2.5, circles; 5, uptriangles; 10, plus; 20, cross; 40, downtriangles. Data are the meanvalues for three independent experiments;SE was ＜20%. DG: docetaxel followed by gefitinib; D+G: gefitinib plus docetaxel; GD: gefitinib followed by docetaxel.

EGFR的異常表達和活化在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，使EGFR成為腫瘤治療的理想靶位，為晚期肺癌患者帶來了新的生存希望，然而臨床使用EGFRTKIs的過程中發現大部分患者或早或晚都將出現耐藥。其中20外顯子790位T突變為M（蛋白水平表現為蘇氨酸轉變為甲硫氨酸）是腫瘤對EGFR-TKIs獲得性耐藥的重要原因，在獲得性耐藥的患者中約占50%左右。T790M耐藥原因主要有兩種：①甲硫氨酸替代蘇氨酸后出現了位阻效應，減弱了酪氨酸激酶殘基與ATP口袋中藥物的結合力；②突變增加了酪氨酸激酶殘基與ATP的親和力，而且是至少一個數量級以上的差別，使突變型受體藥物和ATP的親和力恢復到野生型EGFR水平[28,29]。

H1975（EGFR exon 20 T790M-exon 21 L858R）為攜帶21外顯子敏感性突變的雙突變耐藥細胞株，雙突變造成的ATP親和力的恢復使得加大的治療窗重新關閉，表現為對TKIs的獲得性耐藥。我們經過反復實驗總結出了適合本實驗室條件的操作方法，得到吉非替尼和多西他賽單藥作用72 h對H1975細胞抑制作用的IC50值分別為（10.31±1.05）μmol/L和（3.03±0.13）nmol/L，在以往報道[30]的范圍之內。

圖4 多西他賽與吉非替尼時序作用下的等效線圖。A：多西他賽24 h后吉非替尼48 h；B：多西他賽聯合吉非替尼48 h序貫24 h不含藥完全培養基；C：吉非替尼48 h序貫多西他賽24 h。數據為3次獨立實驗的平均值。Fig 4 Isobologram of docetaxel in combination with gefitinib. A: Pretreated with docetaxel 24 h, followed by gefitinib for 48 h; B: Treated concomitantly with gefitinib and docetaxel for 48 h and incubated in drug-free medium for 24 h; C: Pretreated with gefitinib 48 h, followed by docetaxel for 24 h. Data are the mean values for three independent experiments.

表1 多西他賽序貫吉非替尼組的聯合用藥指數結果Tab 1 The result of CI to pretreated with docetaxel followed by gefitinib

表2 多西他賽聯合吉非替尼的聯合用藥指數結果Tab 2 The result of CI to treated gefitinib combination with docetaxel

表3 吉非替尼序貫多西他賽的聯合用藥指數結果Tab 3 The result of CI to treated pretreated with gefitinib followed by docetaxel

圖5 多西他賽和吉非替尼單藥或序貫作用72 h誘導的H1975凋亡。A：N：正常培養；D：多西他賽單藥；G：吉非替尼單藥。胰酶消化，Annexin V/7-AAD固定流式檢測；B：與正常培養組對比其它組的凋亡率。*：與DG組比較，P＜0.05；#：與D組比較，P＜0.05；C：不同方法處理72 h后H1975凋亡形態改變。實驗重復3次。Fig 5 The effects of docetaxel and gefitinib alone and in the sequential exposure schedules for 72 h on cell apoptosis of H1975. A: N: Without treatment; D: docetaxel alone; G: gefitinib alone. After trypsinized, cells were stained with annexin V/7-AAD and detected by flow cytometry; B: Relative apoptosis levels to control. *: compare to DG group, P＜0.05; #: compare to D group, P＜0.05; C: The apoptosis of H1975 in dealing with different methods after 72 h. Independent experiments are repeated 3 times.

TKIs耐藥后的臨床治療一直處于探索階段，大多為小規模的臨床經驗總結，比如在耐藥后進行鉑類聯合紫杉類化療、化療聯合靶向治療、化療后序貫原靶向治療以及更換另外一種TKIs藥物的嘗試均有報道，但有研究[31]提示一種靶向藥物治療失敗后出現T790M突變的耐藥患者不推薦更換另外一種靶向藥物繼續治療，但對于耐藥后出現非T790M突變的耐藥患者仍可以嘗試更換另外一種靶向藥物繼續治療，臨床可能獲益。

聯合用藥實驗中的“協同”是指“1+1＞2”的效果，如果是“1＜1+1≤2”，只能稱之為“加合”，“1+1＜1”則稱為“拮抗”。所以兩種藥物聯合抑制效果強于單藥并不意味著具有協同作用，其中可能包括有“1＜1+1≤2”的情況。鑒于上述經驗，針對攜帶T790M突變的H1975細胞株，我們設計了3種序貫方案來考察哪種方案的療效最佳。常用于評估兩藥聯合效應的統計學方法有isobolograms模型、Bliss additivism模型及CI方法。Isobolograms模型和CI方法均是基于IC50進行計算的[32]。本實驗中的數據達到了使用isobolograms模型和CI方法的條件。所以我們同時選擇這兩種方法來體外評價上述3種給藥方案對H1975存活的影響。Isobolograms模型和CI方法的原理在試驗方法中已經詳細闡述。

圖6 吉非替尼與多西他賽聯合作用于H1975細胞時的細胞周期分布。A：胰酶消化，PI單染固定流式檢測。B：與正常培養組對比，其它組的周期分布。*：與D和DG組比較，P＜0.05；#：與G和GD組比較，P＜0.05。數據為3次獨立實驗的平均值。Fig 6 Cell cycle distribution of H1975 cells exposed to gefitinib and docetaxel in different sequences. A: After trypsinized, cells were stained with PI and detected by flow cytometry; B: Relative cell cycle distribution levels to control. *: compare to DG and D groups, P＜0.05; #: compare to G and GD groups, P＜0.05. Data are the mean values for three independent experiments.

圖7 吉非替尼與多西他賽聯合下Caspases的活化情況。*：與DG組比較，P＜0.05；#：與D組比較，P＜0.05。數據為3次獨立實驗的平均值。Fig 7 The activities of Caspases to gefitinib and docetaxel in different sequences. *: compare to DG group, P＜0.05; #: compare to D group, P＜0.05.Data are the mean values for three independent experiments.

本研究結果顯示，先用多西他賽24 h后序貫吉非替尼48 h組中5個IC80等效點中3個點落在IC80等效口袋區域的左側，相對于多西他賽聯合吉非替尼48 h組（5個點皆處于IC80等效口袋區域內，且大都處于區域靠右側位置，指示為相加作用）以及吉非替尼48 h后序貫多西他賽24 h組（5個IC80等效點皆處于IC80等效區域右側且遠離等效區域，指示為拮抗作用）表示為協同作用或接近強相加作用。表1-表3中的CI值同樣也證實了isobolograms模型的結論，即多西他賽序貫吉非替尼組較其它兩種給藥方式具有協同增效作用。此結果與EGFR突變野生型和敏感型細胞株的基礎研究[20,21]結果一致，同樣INTACT1、INTACT2、TRIBUTE和TALENT的多中心隨機對照臨床研究[33,34]也得到類似結果。

目前認為細胞的死亡存在3種類型：壞死、凋亡和自噬，有報道[35]稱吉非替尼低濃度僅引起細胞生長的抑制，只有高濃度才會導致細胞的凋亡，并且凋亡主要經死亡受體途徑誘導。但多西他賽誘導細胞死亡的方式可能為凋亡，也可能為其它方式（比如有絲分裂災變），并且在凋亡途徑中可能同時激活死亡受體途徑和線粒體途徑，但未見有明確結論[36]。因此我們在細胞毒性數據及3種序貫給藥方式的基礎上，增加空白組和單藥組，對不同方案下細胞死亡方式中的凋亡途徑進行初步研究，探討不同用藥組下細胞周期分布情況，觀察不同凋亡途徑的交叉和影響，進一步解釋不同方案間存在的療效差異現象。

流式細胞儀分析方法檢測凋亡實驗結果顯示：多西他賽單藥與多西他賽序貫在誘導凋亡結果上較其它組具有明顯差異，但兩種方案間未能得出有統計學意義的結果，數值上多西他賽序貫吉非替尼組略顯優勢。而單藥吉非替尼和吉非替尼序貫多西他賽組，未誘導出明顯凋亡。細胞周期分布實驗中單藥多西他賽和多西他賽序貫吉非替尼組，細胞主要被抑制在G2/M期，而單藥吉非替尼和吉非替尼序貫多西他賽組，細胞主要被抑制在G0/G1期。Caspase活化結果顯示單藥多西他賽和多西他賽序貫吉非替尼組，Caspase-3、Caspase-8明顯活化，而Caspase-9與對照組相比，不僅未被誘導活化，而且活性均有一定程度的抑制。

眾所周知，EGFR-TKIs主要通過抑制EGFR及其下游信號磷脂酰肌醇三羥基激酶/蛋白激酶B（phosphatidyl inositol-3-kinase and protein kinase B, PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶1/2（mitogenactivated protein kinases/extra cell μlar signal-reg μlated kinases,MAPK/Erk1/2）傳導，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移及凋亡。研究[37]發現化療與EGFR-TKIs聯合應用于不同NSCLC細胞，只有細胞EGFR磷酸化（pEGFR）水平增加者才能從后續的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴增無關，也就是說先多西他賽后吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平會明顯增高，明顯提高了后續吉非替尼的療效。同時吉非替尼為細胞周期非特異性藥物，使大量細胞在多西他賽誘導的G2/M期死亡。而吉非替尼與多西他賽同時應用或吉非替尼后序貫多西他賽時，吉非替尼把細胞大量抑制在G0/G1期，而多西他賽為周期特異性藥物，主要作用于細胞有絲分裂期，使多西他賽的療效大打折扣，而吉非替尼導致的EGFR和ERK磷酸化下調作用也不能被同時或序貫應用的多西他賽逆轉，結果說明上述兩種方案未能增強細胞抑制作用，可能與吉非替尼把細胞大量抑制在G0/G1期和多西他賽逆轉EGFR和ERK磷酸化下調失敗有關。

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組存在于細胞質中、具有類似結構的蛋白酶。它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性地切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵，負責選擇性地切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡。根據原域的長度、酶在凋亡途徑中的位置和前體的活化方式，分起始者胱天蛋白酶和效應者胱天蛋白酶。Caspase-8、Caspase-9為起始者胱天蛋白酶，Caspase-3為效應者胱天蛋白酶。Caspase-8主要作用于死亡受體途徑，Caspase-9則主要存在于線粒體途徑中。二者最終都通過活化下游的Caspase-3來造成細胞凋亡。結果顯示和空白組比較，各用藥方案皆主要通過死亡受體途徑中的Caspase-8前體活化從而激活Caspase-3來誘導細胞凋亡，而且多西他賽序貫吉非替尼組Caspase-3、Caspase-8的活化程度遠高于吉非替尼聯合多西他賽組以及吉非替尼序貫多西他賽組，卻低于多西他賽單藥組。然而流式結果顯示多西他賽序貫吉非替尼組的凋亡率反而略高于多西他賽單藥組。值得我們注意的是所有實驗組的Caspase-9的活性并未有統計學差異，這引發了我們的思考：是否存在兩藥聯合后吉非替尼激活多西他賽誘導的自噬或者有絲分裂災變？假如存在的話，自噬和有絲分裂災變同凋亡之間是否會相互轉化？這些問題仍值得我們進一步實驗繼續探索。

本研究在吉非替尼耐藥的H1975細胞株上發現多西他賽序貫吉非替尼與吉非替尼聯合多西他賽及吉非替尼序貫多西他賽相比具有協同增效作用，為臨床晚期TKIs耐藥后T790M突變的患者提供了一條很好的臨床思路，尤其為體力狀態較好的患者帶來了一絲希望。但序貫方案的優化和給藥劑量的詳細確定仍有待進一步體內和臨床實驗的研究。在死亡相關的凋亡通路中，不同給藥方案主要都是通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡的，同時多西他賽序貫吉非替尼組誘導凋亡現象仍值得深入研究。