晚期肺腺癌患者一線化療后T淋巴細胞亞群變化及臨床意義

燕翔 趙曉 焦順昌 孫勝杰 吳亮亮 吳志勇

肺癌的發病率高，預后差。晚期肺癌的治療目前以化療為主，但化療的5年生存率不高，分子靶向治療對生存率的提高也有限。肺癌患者的免疫狀態與患者的腫瘤臨床病理學特征以及與預后的關系成為近年來腫瘤研究焦點之一。在腫瘤細胞免疫中，T細胞起中心調控作用。T細胞分為CD4+、CD8+T細胞，根據細胞表面分子又分為幾大亞類，在維持機體免疫平衡中均起著各自的作用。其中CD4+CD25+調節性T細胞亞群（Treg）具有抑制其它T細胞活化的功能[1]，并與腫瘤免疫逃逸有密切關系[2]，其數量與患者腫瘤進展程度和預后呈負相關。去除Treg或封閉其抑制功能可使腫瘤免疫恢復[3]。CD8+CD28-T細胞存在于腫瘤組織中，具有抑制T、B細胞活性和介導細胞毒活性兩大功能。

多西他賽和培美曲塞與順鉑的聯合方案為目前肺腺癌化療最常見的一線方案。在動物實驗中多西他賽已被證實可選擇性抑制Treg細胞[4]。培美曲塞是一種多靶點抗葉酸代謝細胞毒藥物，對機體免疫功能的影響未明。本研究收集64例晚期肺腺癌患者化療前后外周靜脈血，采用流式細胞技術檢測其外周血中T淋巴細胞亞群占總淋巴細胞比例，與正常對照組相比較。并比較多西他賽聯合順鉑與培美曲塞聯合順鉑化療對肺腺癌患者外周血中T淋巴細胞亞群的影響，以探討化療藥物影響機體腫瘤免疫功能的機制及其可能的影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究收集解放軍總醫院腫瘤內科2010年1月-2011年7月晚期肺腺癌患者，共64例。入選患者均為經病理確診的肺腺癌。根據AJCC分期標準（第7版），均為IIIb期-IV期患者。入選前1個月內未做過其它抗腫瘤治療，近3個月內未用過免疫增強劑，Karnofsky評分＞70分，預計生存期＞3個月。經解放軍總醫院倫理學委員會批準執行，每位入組患者簽署知情同意書，隨機進入多西他賽和培美曲塞治療組。分別在治療前、化療第4天、化療第7-10天（圖表中為簡便起見，以第10天代表）及第1周期化療結束后1周內（第21天前后）對患者采取外周血，并進行流式細胞儀檢測。15例患者因第10天或第21天數據缺失，按失訪處理。最后得到并分析49例患者完整數據，年齡24歲-70歲，中位年齡51歲。其中男27例，女22例。對照組33例均為本院體檢的健康者，年齡26歲-75歲，中位年齡46歲。其中男15例，女18例。

1.2 檢測方法 用流式細胞術檢測被檢者外周血淋巴細胞表面分子CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD25+。整個操作由專人負責；流式抗體購自美國BD公司，儀器為美國BD公司的FASCalibur流式細胞儀。

T細胞亞群操作步驟為：取5 mL全血與適當體積的相應抗體及同型對照抗體混勻室溫避光孵育20 min，加入2 mL流式細胞專用紅細胞裂解液，避光5 min-10 min，1,500 rpm離心5 min，棄上清，洗滌2次，加PBS 0.5 mL混勻上機，在直方圖中框出淋巴細胞群，再分別計數10,000個淋巴細胞，標記出細胞百分率。

1.3 統計分析 本研究所涉及數據均采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析。在T細胞亞群比例比較時，肺癌組及對照組之間采用獨立樣本t檢驗分析（方差不齊時，采用t’檢驗），不同時間點之間采用重復測量的方差分析（若Mauchly's Test of Sphericity P＜0.05，則以Greenhouse-Geisser法校正），進一步多重比較采用LSD法。結果以Mean±SD表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者組與健康組T細胞亞群的比較 肺癌患者組與健康組在性別、年齡分布無明顯差異（P＞0.05）。表1所示，49例肺癌患者CD3+、CD3+CD4+細胞比例明顯低于健康組，比例分別為67.1±11.4 vs 72.0±6.0（P＜0.05），38.1±9.6 vs 42.0±6.4（P＜0.05）。CD4+CD25+（Treg）細胞比例明顯高于健康組，比例為10.8±3.9 vs 8.4±3.5（P＜0.01）。CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-與健康組相比無明顯差異。數據提示，肺癌患者的CD3+、CD3+CD4+、CD4+CD25+等T細胞的數量較健康對照組存在明顯差異，而這些亞群細胞的數量和功能缺陷與肺癌患者的免疫功能狀態有關（表1）。

2.2 肺癌患者化療前后不同時間點T細胞亞群的變化 與化療前比較，49例晚期肺腺癌患者化療后每個時間點CD3+細胞均升高，差異有明顯差異。第4天CD3+CD4+細胞比例及CD4+/CD8+升高，CD8+CD28-降低，差異具統計學意義。第7-10天CD3+CD4+細胞比例明顯升高。第21天患者外周血T淋巴細胞亞群比例與化療前基本相同，提示化療后短期內患者免疫功能有所提高（表2，圖1）。

2.3 多西他賽組與培美曲塞組化療前后T淋巴細胞的變化 將多西他賽+順鉑組與培美曲塞+順鉑組進行分層分析。多西他賽組共納入23例患者，培美曲塞組共納入26例患者。兩組在性別、年齡方面比較無明顯差異。同樣將兩組患者化療后第4、7-10及21天的外周血T淋巴細胞進行比較，結果顯示：多西他賽化療后各個時間點CD3+均升高，差異有統計學意義；其它細胞亞群在化療后未出現明顯變化。而培美曲塞組化療第4天CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+升高，CD3+CD8+及CD8+CD28-比例降低，差異均具有統計學意義。化療后第7-10天CD3+、CD3+CD4+及CD4+/CD8+仍明顯升高，差異具有統計學意義（圖2，圖3，表3）。

2.4 一線化療2周期后疾病進展（progressive disease,PD）的患者與部分緩解（partial response, PR）患者T淋巴細胞亞群變化的統計分析 將檢測結果根據隨訪情況進行分層分析。49例患者經一線化療2周期后，5例患者PD，14例患者PR，其余患者穩定（stable disease,SD）。將PD與PR患者化療后第4、7-10及21天的外周血T淋巴細胞進行比較，結果顯示：兩組患者化療后第10天CD3+均升高；PR組患者化療后第4天及第7-10天CD3+CD4+細胞升高；化療后第4天CD3+CD8+、CD8+CD28-細胞降低，差異有統計學意義（表4）。

3 討論

機體免疫功能在抗腫瘤免疫應答中起著重要作用，近年來肺癌患者的免疫狀態與患者的腫瘤臨床病理學特征以及與預后的關系成為腫瘤研究焦點之一。化療是晚期肺癌的主要治療手段。探究化療對免疫功能的影響和免疫功能與腫瘤治療效果的關系，對于提高腫瘤綜合治療水平、加強對預后的認識有著重要的臨床意義。

表1 肺癌組和對照組T細胞亞群檢測結果（Mean±SD, %）Tab 1 The T lymphocyte subset of the lung cancer patient group and the control group (Mean±SD, %)

表2 化療前后T細胞亞群檢測結果（Mean±SD, %）Tab 2 The T lymphocyte subset before and after chemotherapy (Mean±SD, %)

圖1 T細胞亞群化療前后比例變化趨勢圖Fig 1 The trend of T lymphocyte subset before and after CT(chemotherapy)

圖2 多西他賽組化療前后T淋巴細胞變化趨勢圖Fig 2 The trend of T lymphocyte subset in doxetaxol group

圖3 培美曲塞組化療前后T淋巴細胞變化趨勢圖Fig 3 The trend of T lymphocyte subset in pemetrexed group

多西他賽與培美曲塞聯合順鉑方案由于其安全性好、可耐受度高、療效肯定及住院時間短等原因，是目前臨床上晚期非小細胞肺癌尤其是肺腺癌一線治療中最常采用的方案。本研究采用前瞻性試驗設計，入組患者隨機進入兩種化療方案組，總結試驗結果，分析這兩種化療方案對機體免疫功能的影響，以期為化療與免疫治療的結合及提高臨床療效提供依據。T淋巴細胞是細胞免疫的效應細胞，在腫瘤免疫中起中心調控作用。檢測患者T淋巴細胞表達水平，可以輔助動態分析抗腫瘤藥物治療過程中機體細胞免疫功能的變化。

首先使用流式細胞檢測法分析來自于49例晚期肺腺癌患者的外周血的CD3+、CD4+、CD8+和CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD25+T細胞占外周血淋巴細胞的比例，并與正常人進行比較。CD3+CD4+T為輔助T淋巴細胞，CD3+CD8+T為抑制T淋巴細胞。正常情況下，CD3+CD8+和CD3+CD4+之間保持著動態平衡，CD4+/CD8+下降表示患者處于免疫抑制狀態。 CD8+T細胞根據CD28的表達與否分為抑制性T細胞（Ts，人類表型為CD8+CD28-）和殺傷性T細胞（Tc，人類表型為CD8+CD28+）。CD8+CD28-T細胞存在于腫瘤組織中，是一群終末分化的細胞，被認為具有抑制T、B細胞活性和介導細胞毒活性的功能[5]。CD4+CD25+T（Treg）細胞是一類具有負免疫調節作用的T淋巴細胞亞群。Treg細胞可以抑制識別自身腫瘤細胞的效應細胞的發育和活化，在介導機體腫瘤免疫耐受中起重要作用[6]。近年來研究[7]表明，許多惡性腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環境中的Treg細胞比例都明顯增高，且數量還與患者腫瘤進展程度和預后呈負相關。控制Treg的數量和功能有可能是腫瘤免疫治療的新策略[8]。

表3 不同化療藥物組T細胞亞群檢測結果（Mean±SD, %）Tab 3 The T lymphocyte subset in groups of different chemotherapy drugs（Mean±SD, %）

表4 PD與PR患者T細胞亞群檢測結果（Mean±SD, %）Tab 4 The T lymphocyte subset seperately in PD and PR group (Mean±SD, %)

本實驗結果顯示：肺癌患者外周血CD3+、CD3+CD4+細胞比例明顯低于健康組，P＜0.05。CD4+CD25+（Treg）細胞比例明顯高于健康組，P＜0.01。CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-與正常人相比無明顯差異。惡性腫瘤患者CD4+T細胞亞群的改變情況報道不一，但是多數研究顯示CD4+T細胞亞群在惡性腫瘤患者中是表現為減少的。Treg細胞在多種實體瘤組織及患者外周血中均高于正常對照。說明肺癌患者細胞免疫功能處于抑制狀態，符合腫瘤的免疫逃避機制。

近年的研究發現各種非遺傳因素（如化療藥物）導致的淋巴細胞減少可誘發機體免疫系統的自穩性增生，從而使體內的T細胞數目保持在一定的水平。淋巴細胞自穩性增生可使腫瘤抗原特異性T淋巴細胞克隆在“廣闊”的空間內擴增，增強抗腫瘤的免疫應答[9]。本實驗結果顯示，肺癌患者在化療后CD3+升高，差異有統計學意義。CD3+CD4+細胞比例及CD4+/CD8+明顯升高，CD8+CD28-明顯降低，結果具統計學意義。后各細胞比例逐漸恢復，至第21天與化療前基本相同。提示化療不僅沒有削弱機體免疫功能，且能誘使機體朝正向免疫應答發展。

本實驗還分析了不同化療藥物對患者免疫功能影響的差別。已有許多報道[4,10-15]證實環磷酰胺、多西他賽、氟達拉濱等化療藥物及索拉非尼、抗CD25單抗類靶向藥物等對Treg起選擇性抑制作用。而其它化療藥物對Treg細胞的影響尚未十分明確。為觀察不同化療藥物對免疫功能的影響，本實驗組患者隨機進入多西他賽組及培美曲賽組，兩組患者均為IIIb期-IV期肺腺癌患者，性別、年齡等因素均無明顯差異。實驗結果表明，化療后短期內兩組患者的效應性T細胞CD3+CD4+均出現明顯升高，且培美曲塞組更為明顯，持續時間更長，且伴有CD3+CD8+及CD8+CD28-等抑制性細胞成分的明顯減少。結果提示與多西他塞組比較，培美曲塞似乎對化療后短期內免疫功能的改善有更明顯的作用。根據既往文獻提示，我們預測多西他賽組可能出現Treg細胞的特異性抑制。然而我們著重觀察了化療前后兩組患者的Treg細胞比例，并未觀察到明顯變化，甚至在化療后第4天Treg細胞數量還有所升高，但差異無統計學意義。分析原因，可能與化療合并使用小劑量糖皮質激素進行預處理有關。為了防止皮疹、水鈉潴留及過敏反應等，臨床實際應用培美曲塞及多西他賽時，需在化療前一天、化療當天及化療后一天口服小劑量地塞米松。實驗[14]表明，糖皮質激素可明顯提升外周血Treg細胞數量。激素可能既可抑制效應性T細胞，又可上調調節性T細胞的比例，也可能增強了調節性T細胞的免疫抑制功能。化療藥物雖然可能選擇性地清除CD4+CD25+FoXP3+Treg細胞，但其作用不敵糖皮質激素的影響。另外，化療藥物不同的給藥方式以及研究對象不同的病理類型、疾病分期對免疫功能產生的影響也不同。因此在本實驗中，化療短期內CD4+CD25+總數量表現為上升的結果。而化療7 d-10 d后，化療對機體的短期影響結束，Treg細胞含量可能升高。因此結合臨床實際，本研究在晚期肺腺癌聯合化療對Treg細胞的影響觀察中未復制出與文獻報道相似的結果。同樣，雖然文獻報道多西他賽在動物實驗中可選擇性抑制Treg細胞，但將多西他賽與培美曲塞進行分層分析，并未得出特異性結果。培美曲塞組在化療后第4天CD3+細胞比例升高更明顯，提示似乎培美曲塞對化療后短期內免疫功能的改善有更明顯的作用。

本實驗初步探討了T細胞亞群與近期療效的關系。結果顯示，PR組患者化療后第4天及第7-10天CD3+CD4+細胞升高，化療后第4天CD3+CD8+、CD8+CD28-細胞降低（P＜0.05）。其余細胞成分未觀察到明顯變化。似乎提示化療后體內免疫環境有所改善。但病例數太少，統計結果可能存在偏差。因此該結果是否提示化療后對體內免疫格局的變化與預后有明確關系，尚需要更大規模的臨床試驗進一步證實。

以上結果提示化療對機體免疫微環境具有一定的優化作用，能活化抗腫瘤免疫應答，增強機體的抗腫瘤反應。臨床實際應用中可能影響患者免疫功能的原因很多，誘發抗腫瘤免疫活化的因素還不完全了解。而化療藥物對機體免疫細胞的作用機制以及化療藥物在第幾個周期后發揮明顯作用更是知之甚少。免疫治療在通往臨床應用的途中，還有許多關鍵問題有待解決，包括合并化療藥的給藥方式、免疫治療的切入時機等。而糖皮質激素在腫瘤患者體內引起的免疫功能改變是否影響到腫瘤的發生發展以及化療效果，也需要更多實驗的驗證。