非小細(xì)胞肺癌LVD、MVD、CEAmRNA及KAI1和Kiss-1的表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系的研究

汪國文 王祖義 黎傳奎 王萍 柴大敏 承澤農(nóng)

肺癌已成為癌癥死亡的主要原因，每年大約有120萬人死于肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%以上[1]。其預(yù)后主要由分期決定，同時不同的分期也決定了治療方案的選擇[2]。NSCLC總的5年生存率相對較差，對于外科切除術(shù)后的患者5年生存率從Ia期的70%到IIIa期的25%，大部分都是死于腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。同一分期不同的生存情況提示有影響預(yù)后的其它因素存在[2]。本文通過對NSCLC預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析，包括各臨床病理因素及微血管密度（microvessel density, MVD）、淋巴管密度（lymphatic vessel density, LVD）、外周血癌胚抗原（carcinoembryonic antigen messenger ribonucleic acid , CEAmRNA）和轉(zhuǎn)移抑制基因ろI1和Kiss-1的表達(dá)情況，探討影響肺癌預(yù)后的可能因素，以期對NSCLC的綜合治療提供有意義的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象和標(biāo)本采集 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科2005年12月-2006年8月行手術(shù)治療的NSCLC病例共60例，剖胸探查1例，操作中標(biāo)本破壞2例，實(shí)際入選57例。57例中男性46例，女性11例；鱗癌36例，腺癌16例，支氣管肺泡細(xì)胞癌5例；術(shù)后pTNM分期I期-IV期分別為17例、12例、23例和5例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。檢測LVD和MVD及ろI1、Kiss-1的表達(dá)所選標(biāo)本為石蠟組織切片；檢測CEAmRNA的表達(dá)所選標(biāo)本為術(shù)前明確診斷的NSCLC患者外周血。

1.2 檢測方法

1.2.1 MVD檢測 所選試劑主要有鼠抗人CD31單克隆抗體（克隆號JC/70A）、鼠抗人CD34單克隆抗體（克隆號QBEnd/10）及高溫修復(fù)液和ElivisionTMplus Polyer HRP（Mouse/Rabbit） IHC Kit（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。具體方法見參考文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 LVD檢測

1.2.2.1 試劑及染色方法 鼠抗人單克隆抗體Podoplanin（18H5）購于美國Santa Cruz公司，Elivision二步法試劑盒為丹麥DAKO公司產(chǎn)品，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)Elivision二步法。標(biāo)本均予10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，脫蠟，脫二甲苯，水化。實(shí)驗(yàn)程序按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2.2 結(jié)果判定 結(jié)果判定采用盲法，每張切片由兩名病理科專家分別計(jì)數(shù)。Podoplanin判定標(biāo)準(zhǔn)視內(nèi)皮細(xì)胞形成的條狀、腔隙狀等的孤立或成簇狀結(jié)構(gòu)，棕黃染色的管腔為淋巴管，管腔＜8個紅細(xì)胞大小按一條淋巴管計(jì)數(shù)。Podoplanin染色陽性LVD計(jì)數(shù)方法：先于低倍光鏡（40倍和100倍）下確定5個淋巴管著色最密集的區(qū)域，然后在400倍視野下計(jì)數(shù)淋巴管，取5個視野的均值作為LVD，兩名醫(yī)師計(jì)數(shù)差10%以上者重新計(jì)數(shù)。

1.2.3 Kiss-1和ろI1檢測

1.2.3.1 試劑及染色方法 兔抗人多克隆抗體Kiss-1（FL-145）和兔抗人ろI1（H-173）多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，Elivision二步法試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)Elivision二步法。實(shí)驗(yàn)程序按試劑盒說明書進(jìn)行。抗體工作濃度為1:100。每次用已知Kiss-1和KAI1陽性標(biāo)本切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3.2 結(jié)果判定 Kiss-1蛋白和ろI1蛋白為細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，采用免疫反應(yīng)積分標(biāo)準(zhǔn)即染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積[4]。陽性判定以染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)綜合判定。陽性細(xì)胞百分比：無細(xì)胞染色為0，1%-25%為1，26%-50%為2，51%-75%為3，＞75%為4。染色強(qiáng)度：不顯色或顯色不清為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。兩分值乘積＞3為陽性。

1.2.4 CEAmRNA檢測 采用一步法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，RT-PCR擴(kuò)增，Micro-fluid chip方法進(jìn)行檢測，具體引物及方法見參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 對全部病例進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2011年8月31日。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件，采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)對各臨床病理因素進(jìn)行分析；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，Log-rank檢驗(yàn)比較生存率差異，Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVD、MVD、CEAmRNA及KAI1和Kiss-1的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系 見圖1、圖2、表1、表2。本文對外周血CEAmRNA的檢測結(jié)果與臨床病理之間的關(guān)系與以前研究結(jié)果大致一致，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。按TNM分期把全組資料分為I+II組和III+IV組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組間LVD（P=0.001）、MVD（CD31:P=0.027； CD34:P=0.040）及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1（P=0.044）和Kiss-1（P=0.024）的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移把全組資料分為N0組和N1+N2組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組間LVD（P＜0.001）、MVD（CD31:P=0.002； CD34:P=0.013）及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1（P=0.011）和Kiss-1（P＜0.001）的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LVD、MVD、CEAmRNA及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1和Kiss-1的表達(dá)與年齡、性別、部位、吸煙、病理類型及分化程度無明顯關(guān)系。

2.2 生存影響因素分析 全組57例患者隨訪時間為3個月-81個月，隨訪率為100%。全組中位生存期為34個月，1年、3年、5年生存率分別為60%、32%和18%，；單因素分析顯示TNM分期（P＜0.001）、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、CEAmRNA（P＜0.001）的陽性表達(dá)、MVD（P=0.001）、LVD（P＜0.001）和Kiss-1（P=0.001）的表達(dá)對生存有影響（圖3）。多因素分析顯示TNM分期（P＜0.001）、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移（P＜0.001）和CEAm-RNA（P＜0.001）的表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素（表3）。

3 討論

肺癌的治療水平在提高，但近十年肺癌患者的生存率幾乎沒有改變，快速而廣泛的轉(zhuǎn)移使得對肺癌患者的治療遠(yuǎn)不能令人滿意[6,7]。肺癌的TNM分期被廣泛地用于評價預(yù)后，但即使行根治性切除的I期NSCLC仍有大約30%的患者最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)。對于術(shù)后的患者，雖然病理分期是影響預(yù)后最重要的因素，但由于腫瘤生物學(xué)行為的差異使同一分期的不同患者預(yù)后差異也很大[8]。因此，要進(jìn)一步提高肺癌的生存率，就必須尋找新的預(yù)后影響因素，從而從不同的途徑干預(yù)肺癌的進(jìn)展，以獲得更好的治療效果。

癌的發(fā)生是一個多階段的過程，包括自主增殖信號的獲得、對生長抑制信號的不敏感、對凋亡信號的耐受、持續(xù)的血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移6個必要的步驟[9,10]。本文主要是對影響最后兩個階段的標(biāo)記物進(jìn)行分析，以期獲得能較好反應(yīng)預(yù)后的標(biāo)記物，從而在一定程度上指導(dǎo)臨床治療。在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中血管的生成是一個不可或缺的環(huán)節(jié)。它不僅為腫瘤細(xì)胞提供血供，而且也是轉(zhuǎn)移的重要途徑，而血管內(nèi)皮細(xì)胞染色可以清楚地顯示腫瘤的血管密度，反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)特性。常用于血管內(nèi)皮細(xì)胞染色的試劑有CD31、CD34、CD105、FVIII等。Meert[11]和Mineo[12]等研究發(fā)現(xiàn)MVD與NSCLC的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本項(xiàng)研究顯示MVD與預(yù)后有關(guān)（P=0.001），但Cox生存分析顯示其不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素。因此，我們認(rèn)為腫瘤的血管生成有利于腫瘤的生長和經(jīng)血行進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但其對預(yù)后的影響與腫瘤細(xì)胞自身的侵襲性有關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞穿透血管內(nèi)皮進(jìn)入血液循環(huán)的能力。

表1 57例NSCLC患者LVD和MVD與各臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 1 The relationship between LVD、MVD and clincopathological parameters

6 6 8 4 1 7 2 P 0.16 0.29 0.41 0.92 0.45 0.4801.0＜00.00 χ297 4 9 8 3 946 RN A 1.91 1.09 0.65 0.00 0.56 0.48 17.3 9.72 Am CE tive ga 6985 Ne 262217141916102011262110 sitive Po 20515111792371610197818719 0.51 9 4 3 0.14 1 9 0.40 4 0.68 0.70 P 1 0.63 0.04 0.011 0 χ2 0.166 0.423 2.142 0.688 0.141 0.237 4.04 6.474 KA I1 tive ga 8 20176 11148 1422 Ne 1513201315919 eters Po sitive 263209209209171219102181910 aram l p gica lo 5 5 3 5 9 7 4 01 atho P 0.57 0.66 0.55 0.72 0.28 0.22 0.02.0＜0 0.315 χ274 0.185 2 7 2 23.4關(guān)an 系d clincop 0.35 0.12 1.12 1.45 5.09 13間的NA之mR Kiss-1 tive 2572012181423916162481517923特征EA ga理床Kiss-1、C Ne病臨2141781691961691510196196與各AI1、sitive Po RN Af K Am CE e rates o n 46113720342342153225391834232829 iss-1和th en I1、K etwe r KA n atio ce者nship b r ce sis患C us can n+w etasta CL ssific mo us can ristic NS ell le ua ar)te nter e m ery 2例7Th e relatio te g ic cla mo tiatio ra od 2 5 xMa arac le ma Fe ＞5 55≤5in s Ye No tion Ce riph Pe ua Sq n-sq No de Mo or Po IV b 2e (ye ok + N II Histolog h n Differen I+e III+N0N1表Ta Ch Se Ag Sm ca Lo Stag mp Ly r 48237)Up pe .0.15.2(B 181453 xp OR95%C l for E r we 040 Lo 2.72 2.11 6.28 7 7.07 9 5.46 9.17 18 P 01.00101＜0.0＜0.0＜0 ld Wa 64.27089 16.2 1227.9 SE 0.48 35 0.488 0.54 s se ca LC 790 SC B 7 N 1.94 1.69 2.90分sis o f 5析生na 存ly素因iv al a的多rv sis者su C 患te CL etasta NS aria e m 7Mu ltiv A例od ge 3 5h n RN表Ta b 3 Item mp Ly M sta TN A m CE

圖1 LVD、MVD計(jì)數(shù)和KAI1、Kiss-1的陽性表達(dá)（免疫組化，×400）。A：微血管密度（CD31）；B：微血管密度（CD34）；C：淋巴管密度；D：肺腺癌KAI1；E：肺腺癌Kiss-1。Fig 1 The counts of LVD, MVD and positive expression of KAI1, Kiss-1 (Immunohistochemistry, ×400). A: The microvessel density (CD31)；B: The microvessel density(CD34)； C: The lymphatic vessel density； D: KAI1 in adenocarcinoma； E: Kiss-1 in adenocarcinoma.

圖2 上方是CEA mRNA和GAPDH mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的波峰曲線，下方是對應(yīng)的電泳圖Fig 2 The upper panel showing ridge curves of amplification of CEA mRNA and GAPDH mRNA, and the lower panel showing the electropherograms of the same samples (basal line of ridge is 0.5)

圖3 生存曲線。A： 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）；B： TNM分期（P＜0.001）；C：CEA mRNA表達(dá)（P＜0.001）。Fig 3 Cumulatiive survival time curves. A: Negative and positive lymphatic node (P＜0.001)； B: Different TNM stages (P＜0.001)； C: CEA mRNA positive and negative expression (P＜0.001).

淋巴轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要方式之一，也是判斷患者預(yù)后的重要因素。Kadota等[13]研究了微小淋巴管、管狀淋巴管和總淋巴管密度與患者預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果顯示微小淋巴管密度是影響預(yù)后的因素。王艷等[14]研究顯示高淋巴管密度是NSCLC患者有意義的、獨(dú)立的不良預(yù)后因素。本項(xiàng)研究表明，以Podoplanin為標(biāo)記物的LVD是影響預(yù)后有意義的風(fēng)險因素，同相關(guān)研究結(jié)果一致。作為組織液回收的途徑，淋巴管的生成能增加腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管進(jìn)行轉(zhuǎn)移的幾率，作為主動引流的淋巴管，其密度可能直接關(guān)系到患者的轉(zhuǎn)移并進(jìn)而影響預(yù)后。

細(xì)胞遺傳學(xué)改變可導(dǎo)致其生長調(diào)控失衡使細(xì)胞增殖失去控制，但無限制的生長并不能引起癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，后者的表型還需要轉(zhuǎn)移抑制基因功能缺失等分子事件[15]。在對胰腺癌、口腔癌、宮頸癌、結(jié)腸癌及頭頸癌等多種實(shí)體瘤的研究中都發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因KAI1基因表達(dá)下調(diào)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)較不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織降低，在轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)較原發(fā)癌降低更明顯[16]。陳清勇等[17]研究顯示在不同的腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移中，KAI1/CD82的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Kiss-1在部分腫瘤中表達(dá)缺失并與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。本研究顯示在腫瘤的TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，KAI1及Kiss-1的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同為轉(zhuǎn)移抑制基因，分析顯示Kiss-1的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，而KAI1的表達(dá)不能反映預(yù)后，是標(biāo)本量的影響還是有其它內(nèi)在機(jī)制的影響還需進(jìn)一步研究。近期有研究表明[19,20]，對腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用的基因表達(dá)產(chǎn)物腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（MTA1）的表達(dá)是影響I期NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。

CEA是基因CEACAM5的產(chǎn)物，而該基因只位于各種黏膜上皮和上皮來源的癌細(xì)胞，因此在外周血檢測到CEAmRNA則可表明其外周血循環(huán)中存在有癌細(xì)胞，并間接證明上皮來源的腫瘤已經(jīng)出現(xiàn)血行微轉(zhuǎn)移。已有研究[21]顯示CEAmRNA是反映NSCLC微轉(zhuǎn)移的一個可靠指標(biāo)。Benlloch等[22]采用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)對縱隔淋巴結(jié)中CEACAM5的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其可以對淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評價，與傳統(tǒng)分期相比，對復(fù)發(fā)危險度的評估具有更高的精確度。本文對外周血CEAmRNA的檢測結(jié)果與臨床病理之間的關(guān)系與以前研究結(jié)果大致一致[5]，生存分析顯示CEAmRNA的表達(dá)是影響預(yù)后有意義的風(fēng)險因素。同時，本實(shí)驗(yàn)所用的微流控芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳相比具有明顯的優(yōu)勢[23]。

除了傳統(tǒng)的TNM分期和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MVD、LVD及Kiss-1和CEAmRNA的表達(dá)是影響生存的有意義因素，而Cox比例風(fēng)險模型分析顯示淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期和CEAmRNA的表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，因此，在有條件的前提下術(shù)前對NSCLC患者進(jìn)行該項(xiàng)檢測并采取相應(yīng)的治療方案，有可能在一定程度上改善患者的預(yù)后。