EGFP標記的Lewis肺癌細胞構建裸鼠惡性胸腔積液模型

馬興群 孫宇 王守巨 楊志堅 宋勇

惡性胸腔積液（malignant pleural effusion, MPE）是晚期肺癌的常見死亡原因之一，臨床治療效果差，建立惡性胸腔積液模型具有積極意義。已報道[1]可利用經尾靜脈、經氣管內和經胸膜腔接種瘤細胞的方法建立MPE模型，但是經氣道接種，手術相關死亡率高達17%，腫瘤定植在氣道或者肺部，但很少累及胸膜，成胸水率低[2]，同一株肺癌細胞分別經尾靜脈和經胸膜腔接種，后者成胸水率更高，胸水量更大，并能避免腫瘤細胞在多臟器轉移[3]。經胸膜腔接種方法雖與腫瘤細胞轉移到胸膜腔的生物學行為不盡相同，但是可以單獨地研究腫瘤細胞在胸膜腔內的一系列生物學行為。綠色熒光蛋白（green fl uorescnt protein, GFP）是一種非酶性報告基因，轉染腫瘤細胞后，將隨著腫瘤細胞的分裂、生長而傳給下代，也將隨著腫瘤細胞的死亡而消亡，在轉基因及腫瘤活體成像研究中得到廣泛應用[4]。活體熒光顯像技術為直接觀察腫瘤的發生、生長、轉移、血管生成和腫瘤細胞與宿主微環境的相互作用等生物學行為及直接客觀評價抗腫瘤藥物療效提供了重要的手段。迄今為止，國內尚無該技術用于MPE模型的報道。因此，本研究擬通過表達增強型綠色熒光蛋白的Lewis肺癌細胞（LLC-EGFP）經胸膜腔接種方法，建立裸鼠惡性胸腔積液模型，并應用小動物活體熒光成像系統觀察腫瘤的生長，進一步探索其生物學特性，用于研究肺癌的胸膜轉移和臨床前期藥物研發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 LLC-EGFP：購自美國ATCC（AmericanType Culture Collection美國組織細胞庫）。

1.1.2 實驗動物 BALB/c（nu/nu）裸鼠，35只雄性，5只雌性， 4周齡-6周齡，體重19 g-27 g。所有裸鼠在SPF級屏障系統中飼養并進行實驗（實驗室使用許可證編號：SYXK(蘇)2007-0011）。飼養室相對濕度為55%±10%，溫度為22oC±2oC，光照12 h明暗交替，裸鼠飼養用的飼料為鈷60輻射滅菌過的大小鼠專用顆粒飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）。

1.1.3 儀器設備 西門子SENSATION 16獲取CT圖像，管電壓120 kVp，電流93 A；動物活體熒光影像系統由體視顯微鏡（ZOOM645S，江南禹成光學儀器有限公司）；CDC（Retiga Exi cooled Digital Color型，美國QIMAGING公司）；熒光激發儀（LG-150-A型，南京超騰科技發展有限公司）組成。

1.2 方法

1.2.1 LLC-EGFP細胞系 在濃度為10%的RPMI-1640培養液中37oC、5%CO2飽和濕度條件下培養，每3天傳代1次，取生長良好細胞用于實驗。

1.2.2 惡性胸腔積液裸鼠模型的建立 將LLC-EGFP細胞懸浮于磷酸緩沖液（PBS）中，調整細胞濃度為5×105/50 μL。氯胺酮配比液肌肉麻醉，小鼠仰臥位呈大字型固定，消毒心前區皮膚，于胸骨柄右側0.5 cm處做一縱行切除，切口長0.5 cm，分離皮膚及皮下筋膜，露出肋間肌肉，棉簽壓迫止血。微量移液器抽吸50 μL細胞懸液，于顯微鏡下避開血管，經肋間隙注入胸膜腔，此過程中速度不宜過快，針尖注入深度約3 mm-5 mm，以免刺破臟層胸膜或者傷及肺部。注射完畢后縫合傷口，酒精棉球消毒，待裸鼠蘇醒后安放于原飼養籠內，給予充分飼養和飲水。整個過程在無菌操作臺上完成。

1.2.3 監測指標 ①術后每天觀察動物一般狀態，包括進食、活動、外觀、對外界刺激的反應。②觀察腫瘤生長：接種后第4天開始，每隔3天隨機麻醉處死3只動物，擬觀察時間為3周。解剖荷瘤鼠，分別于自然光源和激發光源下拍照，使用小動物活體成像系統檢測GFP的表達。③其余小鼠在發現GFP表達后第3天，行胸部CT檢查，觀察該時間點的胸水形成并計算成胸水率；第14天及第21天重復檢查并計算成胸水率。發現胸水的小鼠在耳朵上做小切口以示標記，觀察與無胸水小鼠的生存時間差異。當裸鼠出現惡病質后，解剖荷瘤鼠，肉眼觀察腫瘤生長情況及周圍臟器受累情況，并拍照。④所有小鼠解剖時先暴露腹腔，用1 mL注射器在雙側橫隔下抽吸胸水，并計量，若同一時間獲得多份胸水標本，計算其平均體積，胸水涂片行脫落細胞學檢查。⑤取胸膜上腫瘤組織行HE染色。

1.2.4 胸部CT掃描方法 小鼠麻醉后，呈仰臥位固定頭部，探測器準直器64 mm×0.6 mm，機架旋轉時間為0.5 s，螺距為1.4，管電壓為120 kVp，參考管電流93 A，將掃描獲得的圖像實時傳輸到多功能圖像后處理工作站（Syngo MMWP CTworkplaceVA30A）。

1.2.5 拍照方法 充分暴露小鼠胸腔，使用小動物活體成像系統檢測GFP的表達，發射波長為520 nm，激發波長為480 nm，曝光時間為1 s。

1.2.6 HE染色方法和胸水圖片制作方法 制作方法參考相關文獻[6]。

1.2.7 DT2000圖像分析軟件分析腫瘤積分光密度（intergral optical density, IOD）值 設置軟件參數為周長和積分光密度，對胸腔內腫瘤結節進行手動測量周長，系統自動生成相對應的IOD值，并傳到Excel表上，計算每只小鼠的IOD值總和，每只小鼠重復檢測3次，取平均值。以接種時間為橫坐標，取該時間點的胸水平均體積為縱坐標，繪制胸水形成曲線，并分析同一只小鼠的胸水量與IOD值的相關性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計學分析。相關性檢驗分析小鼠胸水量與其腫瘤積分光密度之間的相關性，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 活體熒光成像觀察腫瘤生長 整個手術過程順利，術中4只小鼠死亡，其余小鼠均完成實驗。21只小鼠用于觀察腫瘤生長。第4天胸壁上可見綠色熒光，第10天出現對側胸膜、肺門和縱隔淋巴結轉移，第16天轉移灶體積明顯增加，第25天腫瘤組織填滿整個胸腔（圖1）。2.2 成胸水率、生存時間和腫瘤轉移 15只小鼠用于此部分實驗，第7天可見2只小鼠有單側胸腔積液，最早成胸水率為13%，第14天成胸水率為46%，第21天發現5只有雙側胸腔積液，3只有單側積液，最高成胸水率為53%。圖示為同一只小鼠分別在第7天、第14天和第21天的胸部CT檢查（圖2）。壁層胸膜上腫瘤組織切片行HE染色，可見腺癌細胞聚集，胸水涂片染色提示LLC細胞核大，染色深（圖3）。小鼠平均生存期為28.8天，有胸水小鼠在第20天以后活動量明顯下降，呼吸急促，皮膚變為蒼白色，對外界刺激的反應差，相對無胸水小鼠，生存時間偏短（圖4）。解剖荷瘤鼠，大體觀察可見小鼠的胸膜及縱隔內多發轉移性腫瘤結節，成顆粒樣聚集，顏色灰暗，少數瘤體出現破潰；熒光顯微鏡觀察轉移灶成像更加清晰，其中13只發生縱隔及肺門淋巴結轉移，11只發生對側胸膜轉移，3只出現心包積液，轉移率分別為87%、73%和20%。而肝臟、骨骼、腎上腺尚未出現轉移（圖5）。

2.3 胸腔積液形成曲線繪制，胸水體積與腫瘤積分光密度的相關性分析 36只小鼠完成實驗，共17只小鼠有胸腔積液。第10天胸水平均體積逐漸增加，第16天達到高峰，最大量為0.5 mL，后期胸水量稍有下降。胸水形成曲線與影像學觀察結果基本一致（圖6）。 小鼠在熒光體視顯微鏡下拍照，經過后期DT2000圖像分析軟件處理腫瘤積分光密度。對胸水體積和積分光密度進行相關性分析，兩者之間成線性關系，小鼠的胸水量與對應的積分光密度明顯相關（r=0.91, P＜0.000,1）（圖7）。

3 討論

1972年Stanton等[5]經氣道吸入方法建立了MPE模型，此后出現了多種MPE模型，宿主的免疫狀態、腫瘤細胞的選擇、腫瘤細胞導入胸膜腔的位置和途徑是這些模型之間的主要區別。侵襲性強并能分泌血管內皮生長因子的腫瘤細胞是構建MPE的前提[3]，近年來多數學者選擇經胸腔接種腫瘤細胞直接經胸膜腔接種，雖與腫瘤細胞自發轉移到胸膜腔的行為不完全一致，但是可以單純研究瘤細胞到達胸膜腔的后續行為，包括腫瘤新生血管形成、腫瘤生長、侵襲、轉移以及MPE形成等。2005年Stathopoulos[6]經胸膜腔接種成功建立MPE模型。此模型在直視下做皮膚、皮下筋膜和肋間肌肉切口，容易損傷肋間血管，小鼠出血多，同時壁層胸膜薄弱，進針后無明顯胸膜突破感，不易掌握針尖位置。將靛藍染料加入細胞懸液中，多次發現藍色細胞懸液不在胸膜腔內，而在縱隔內或者肺部。此種方法穩定性不高，成瘤率不能保證，動物消耗多，不適合初學者。本次實驗借助顯微鏡進行操作，鏡下清晰可見小鼠心臟搏動、雙側肺隨呼吸而上下浮動以及肋間血管，肋間隙進針，方向明確。微量移液器有計量精準、針尖圓盾的優點，相對容易控制進針速度，體式顯微鏡為實驗室常用設備，成本低，操作簡便，動物損傷相對小，模型穩定，有很好的重復性，成瘤率和成胸水率高。首次將LLC-EGFP細胞接種到胸膜腔內，動態觀察到少量腫瘤細胞形成的瘤細胞團塊、腫瘤細胞浸潤周圍組織以及腫瘤細胞向遠處轉移等一系列過程，與既往的MPE模型相比，本模型通過觀察綠色熒光蛋白的表達，能客觀評價LLC細胞在裸鼠胸腔內的生長情況，從而能夠發現肉眼無法觀察到的微小轉移灶和淋巴結轉移，在進一步探索腫瘤細胞發生胸膜轉移的機制的研究中有重要價值。

圖1 活體熒光成像動態觀察腫瘤細胞接種后裸鼠胸腔內腫瘤生長。A：第4天右側壁層胸膜上可見綠色熒光表達（箭頭所示）；B：第10天腫瘤向對側胸膜、縱膈和肺門淋巴結轉移； C：第16天轉移灶數量逐漸增多，體積逐漸增加；D：第25天腫瘤組織填滿整個胸腔。Fig 1 Dynamic observation of fluorescence imaging of tumor in the cavity of nude mice after LLC-EGFP cells inoculation. A: Green fluorescence was scaned in the right parietal pleural at day 4 (arrow)； B: Contralateral pleural metastasis, mediastinal and hilar lymph node metastasis were found at day 10； C: Tumor volume and tumor foci were also obviously increased at day 16； D:The whole chest was entirely occupied at day 25.LLC-EGFP: Lewis lung cancer-enhanced green fluorescent protein.

圖2 胸部CT連續觀察同一只裸鼠胸腔積液形成。A：第7天見右側胸腔積液；B：第14天出現雙側胸腔積液，體積較前增加；C：第21天見胸腔積液稍減少（箭頭所示）。Fig 2 Continuous observation of malignant pleural effusion via CT imagines on nude mise after LLC-EGFP cells inoculation. A: Malignant pleural effusion (MPE) was scaned in the right cavity at day 7 (arrow)； B: A developing pleural effusion can be seen in the bilateral cavity at day 14 (arrows)；C: The volume was slightly decreased at day 21 (arrows).

圖3 胸膜腫瘤的組織學檢查和胸水脫落細胞學檢查。A：胸膜上的腫瘤組織行HE染色，提示腫瘤由腺癌細胞構成；B：腫瘤侵潤壁層胸膜；C：胸水涂片用改良型吉姆薩染色行脫落細胞檢查，提示LLC細胞核大、深染（×200）。Fig 3 Histology of pleural tumors and cytology of malignant pleural effusions in nude mice. A: Section through a small parietal pleural Lewis lung cancer implantation stained with hematoxylin and eosin shows that pleural tumors consisted of adenocarcinomatous cells； B: Tumors grew on the pleural surface. C: Representative photomicrograph of a cytospin from several specimens of malignant pleural effusion stained with modified Wright's-Giemsa stain, LLC cells with large nuclei and visible nucleoli (arrow)(×200).

圖4 裸鼠生存時間曲線。15只小鼠分別在25天-31天內死亡，平均生存時間為28.8天。有胸水小鼠在20天以后出現消瘦，進食減少，呼吸急促，對外界刺激的反應差，生存時間較無胸水小鼠偏短。Fig 4 Survival curve of nude mice. 15 mice died during 25 d-31 d and the average survival time was 28.8 d. Mice bearing pleural effusion appeared emaciated, loss of appetite,shortness of breath and insensitivity to external stimuli at 20 d after LLC-EGFP cells inoculation. The survival time was shorter compared to nude mice without pleural effusion.MPE: malignant pleural effusion.

圖5 裸鼠自然死亡腫瘤的解剖觀察。A：大體觀察；B：熒光照片。整體熒光成像對微小轉移灶顯像比自然光下大體照片顯像更為清晰。Fig 5 Observation of nude mouse after thoracic anatomy. A: The general picture；B: Fluorescence imaging. Compared to the general picture, the fluorescence imaging is more clear to detect minor tumours.

圖6 胸腔積液生成曲線：接種后第10天發現血性胸腔積液，量約0.1 mL，隨接種時間延長，胸水平均體積逐漸增加，第16天達到高峰0.5 mL，此后維持在0.3 mL-04 mL之間。Fig 6 The formation curve of malignant pleural effusion. The nude mouse were sacrificed periodically after incubation,bloody pleural effusion was seen at day 10 and the volume was 0.1 mL. Mean volume of pleural fluid increased gradually after inoculation, which reached in a peak at day 16 and the value is 0.5 mL. Since then, it maintained between 0.3 mL-0.4 mL.

圖7 胸水體積和積分光密度之間的相關性分析。小鼠的胸水體積與其積分光密度值明顯相關（r=0.91, P＜0.000,1）。Fig 7 Correlation analysis of the pleural fluid volume and the integral optical density after incubation. Significant correlation(r=0.91, P＜0.000,1) were observed between pleural fluid volume and integral optical density .

目前多數文獻[6,7]報道在瘤細胞接種后2周內胸部CT可見胸腔積液形成。在病情發展過程中，各時間段胸水生成量及其發生率都在不斷變化中。但是目前尚無小鼠MPE模型報道相關數據。本次研究在建模后第7天即行胸部CT檢查，并發現2只小鼠有單側胸腔積液，成胸水率為13%。而在第7天隨機解剖小鼠時并未發現胸水，主要與早期成胸水率低有關。隨后多只小鼠在同一天發現有血性胸水，平均體積隨接種時間逐漸增加，第16天達到峰值，量為0.5 mL。本次實驗最高成胸水率為56%。LCC細胞屬于鼠源性肺腺癌細胞，與臨床上肺腺癌患者終末期并發胸腔積液的幾率比較接近。2周后對小鼠行胸部CT檢查可見雙側胸腔積液，與文獻報道相符合。

IOD為所測結構范圍內各像素的光密度值之和，復旦大學肝癌研究所建立的肝癌原位移植模型發現IOD和腫瘤體積相關[8]。腫瘤壞死部分不分泌熒光蛋白，故IOD表達不僅與體積相關，還與功能相關，IOD值實質上是有功能的活細胞光密度的總和。本實驗對胸腔內腫瘤結節檢測IOD值 ，發現小鼠胸水量與腫瘤IOD值明顯相關。這一現象考慮可能與腫瘤新生血管形成有關：腫瘤細胞是代謝活動高度旺盛的細胞，它要持續生長必須有充足的養分供應，故腫瘤必須形成提供自身營養的新生血管[9]，由于腫瘤血管的生成過程是一種失去正常控制的無序狀態，與正常血管結構相比，腫瘤新生血管的結構缺乏完整性，管壁薄弱，缺乏平滑肌和完整的基底膜，內皮細胞之間存在較大的縫隙，通透性強，血管網結構紊亂，有大量的盲端、動靜脈短路以及局部膨出，導致滲出增加及組織間高壓，同時也易于癌細胞穿透發生遠處轉移。此外，腫瘤細胞分泌的一些因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等，促進腫瘤微血管發生以及血管壁通透性增加[10]。上述機制也是惡性胸腔積液形成的重要原因之一，隨著新生血管形成的增加，腫瘤體積逐漸增大，有功能的活細胞代謝旺盛，IOD值呈上升趨勢，滲出液生成也隨之增加。胸水量和IOD值隨接種時間延長逐漸增加，而到終末期，腫瘤組織缺血、破潰、壞死，IOD和胸水體積不再增加。在同一只小鼠，IOD和胸水量之間的變化，以新生血管為紐帶呈現一定的相關性。Stathopoulos[6]發現胸膜上腫瘤結節數量與胸水量有相關性 （P＜0.005）。在惡性胸腔積液的抗血管生成治療中，通過檢測IOD值的變化，可間接反映胸水體積的變化趨勢，有助于療效評價。由于本實驗裸鼠數量有限，需要增大樣本量，進一步探討該實驗現象。

熒光體視鏡未發現腫瘤侵及肺部、頭顱、骨骼等常見肺癌轉移部位，考慮與熒光成像的特性有關，由于生物的自體熒光及組織光吸收散射作用的影響，熒光成像的最高靈敏度也只能檢測到約1×106個細胞[11]。另外，能否在活體檢測GFP腫瘤細胞的轉移，除了需要轉移的腫瘤細胞達到一定數量外，與轉移灶在體內的位置密切相關。胸腔內轉移瘤體積小，又受到氣體和皮膚的干擾，在體外活體觀察熒光的強度大幅度減弱。在預實驗中經可逆性皮瓣可觀察到局部范圍的綠色熒光，但遠處微小轉移灶顯像不清晰。皮瓣可擴大欲檢測器官的熒光通路，我們經可逆性皮瓣成功觀察到裸鼠肺癌原位移植瘤的生長和轉移[12]，但是對胸腔內多發、微小轉移灶，皮瓣不能提供足夠的熒光通路，此外，胸腔內腫瘤生長和轉移較快，頻繁打開皮瓣對裸鼠損傷較大，部分裸鼠尚未觀察到遠處轉移時已經死亡，只能將裸鼠處死并打開胸腔進行觀察。據文獻[13]報道，目前已發現的最亮的熒光蛋白是一種叫Katushka的紅色熒光蛋白，發射波長超過620 nm，能減少組織吸收和散射，具有快速成熟、高pH穩定性和光穩定性的特點，可對深部腫瘤、轉移性淋巴結等進行活體觀察。將來可能會使胸腔內轉移瘤的活體、非侵入觀察成為現實。

綜上所述，本實驗用經胸膜腔注射方法，首次建立了表達綠色熒光蛋白的胸腔積液模型，通過觀察綠色熒光蛋白的表達和胸腔積液的形成特征，探索了肺癌細胞侵襲胸膜、轉移的特征，以及胸腔積液與腫瘤熒光面積、IOD值之間的關系，實時模擬了晚期肺癌侵襲胸膜的一系列生物學行為，為探索藥物治療肺癌合并惡性胸腔積液提供了科學、合理的實驗研究平臺。